عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة
Summary
يصف هذا البروتوكول العزل شبه الآلي للجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الدهنية وتحقيق تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. استخدام مفكك الأنسجة لهضم كولاجيناز يقلل من التباين التجريبي ويزيد من التكاثر.
Abstract
تتيح الدراسة المختبرية لتمايز الخلايا الشحمية ذات اللون الأبيض والبني والبيج التحقيق في وظائف الخلايا الشحمية المستقلة للخلايا الشحمية وآلياتها. خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة متاحة للجمهور وتستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن ظهور الخلايا الشحمية البيج في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للإشارات الخارجية يصعب تلخيصه إلى أقصى حد باستخدام خطوط خلايا الخلايا الشحمية البيضاء المتاحة للجمهور. عادة ما يتم تنفيذ عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الأولية الأولية وإجراء تمايز الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن فرم وهضم كولاجيناز الأنسجة الدهنية باليد يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث. هنا ، نقدم بروتوكولا شبه آلي معدل يستخدم مفكك الأنسجة لهضم الكولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF ، بهدف تقليل التباين التجريبي وتقليل التلوث وزيادة قابلية التكاثر. يمكن استخدام الخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها والخلايا الشحمية المتمايزة للتحليلات الوظيفية والآلية.
Introduction
تجذب بيولوجيا الأنسجة الدهنية اهتماما متزايدا بسبب الانتشار المتزايد للسمنة ومرض السكري من النوع 2 على مستوىالعالم 1. تخزن الخلايا الشحمية الطاقة الزائدة في شكل قطرات دهنية ، يتم إطلاقها عند الجوع. علاوة على ذلك ، تحافظ الأنسجة الدهنية على توازن الطاقة الجهازية من خلال العمل كعضو في الغدد الصماء والتواصل مع الأنسجة الأخرى 2,3. ومن المثير للاهتمام أن كلا من الأنسجة الدهنية الزائدة (السمنة) وفقدان الدهون (الحثل الشحمي) مرتبطان بمقاومة الأنسولين ومرض السكري1. تنقسم الخلايا الشحمية إلى ثلاثة أنواع: الأبيض والبني والبيج1. تخزن الخلايا الشحمية البيضاء بشكل أساسي الطاقة الزائدة كدهون ، بينما تبدد الخلايا الشحمية البنية والبيج الطاقة في شكل حرارة عبر بروتين فصل الميتوكوندريا -1 (Ucp1) 1,4. والجدير بالذكر أن الخلايا الشحمية البيج (وتسمى أيضا الخلايا الشحمية البنية “المستحثة”) تظهر في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للتحفيز البارد أو الودي وتظهر أنماط التعبير الجيني التي تتداخل مع ولكن تختلف عن تلك الموجودة في الخلايا الشحمية البنية “الكلاسيكية”5. في الآونة الأخيرة ، تم توقع الخلايا الشحمية البنية والبيج كأهداف محتملة للعلاجات المضادة للسمنة ومكافحة مرض السكري التي تهدف إلى “تعزيز تبديد الطاقة” بدلا من “قمع استهلاك الطاقة”4. بشكل داعم ، تم الإبلاغ عن أن أليل الخطر لمتغير السمنة FTO rs1421085 في البشر ، والذي يظهر أقوى ارتباط مع ارتفاع مؤشر كتلة الجسم (BMI) بين المتغيرات الشائعة6,7 ويعرض تفاعلات مختلفة بين الجينات والبيئة 8,9 ، ينظم سلبا تمايز الخلايا الشحمية البيجووظيفتها 10. يعرف γ المستقبلات المنشط بتكاثر البيروكسيسوم (PPARγ) بأنه منظم النسخ الرئيسي لتكوين الدهون وهو ضروري وكاف لتمايز الخلايا الشحمية11. تعتبر منظمات النسخ ، مثل المجال المتماثل PRD1-BF1-RIZ1 الذي يحتوي على 16 (PRDM16) ، وعامل الخلية البائية المبكر 2 (EBF2) ، والعامل النووي I-A (NFIA) ، ضرورية لتمايز الخلايا الدهنية البنية والبيج ووظيفتها12،13،14،15،16،17،18. من ناحية أخرى ، تتطلب برمجة جينات الخلايا الشحمية البيضاء منظمات نسخية ، مثل بروتين محسن يشبه محول الطاقة 3 (TLE3) وبروتين إصبع الزنك 423 (ZFP423) 19،20،21.
تتيح أنظمة النماذج في المختبر إجراء الدراسات الجزيئية التي تهدف إلى تحسين فهم الآلية (الآليات) الكامنة وراء وظائف واختلالات الخلايا الشحمية. على الرغم من وجود خطوط خلايا preadipocyte المتاحة للجمهور والخالدة مثل 3T3-L1 و 3T3-F442A22،23،24 ، فإن ثقافة الخلايا الأولية الأولية والتمايز إلى الخلايا الشحمية ستكون نموذجا أكثر ملاءمة للدراسة في تكوين الدهون في الجسم الحي. يعد عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران طريقة معروفة للحصول على الخلايا الأولية25,26. ومع ذلك ، فإن هضم كولاجيناز للأنسجة الدهنية ، والذي يتم إجراؤه عادة باستخدام شاكر بكتيري مع رف أنبوبي ، يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث27,28. هنا ، نصف بروتوكولا بديلا يستخدم جهاز فك أنسجة فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) اللطيف لهضم كولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، وصفنا بروتوكولا لعزل SVF من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا preadipocytes وإجراء تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. أدى استخدام جهاز فصل الأنسجة لهضم الكولاجيناز إلى تقليل التباين التجريبي ، وتقليل خطر التلوث ، وزيادة قابلية التكاثر. في حين أن هذا الإجراء هو خطوة حاسمة ضمن ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا تاكاهيتو وادا وسايكو يوشيدا (جامعة طوكيو ، طوكيو ، اليابان) على مساعدتهم التجريبية. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية إلى Y.H.: منحة بحثية من برنامج الباحث الشاب الممتاز بجامعة طوكيو. الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة KAKENHI للعلماء في بداية حياتهم المهنية ، رقم المنحة 19K17976 ؛ منحة للعداء الأول لأبحاث السكري المستقبلية (FFDR) من مؤسسة اليابان لعلم الإنزيمات التطبيقي ، رقم المنحة 17F005 ؛ منحة من مؤسسة البحوث الدوائية ؛ منحة من مؤسسة موتشيدا التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية ؛ منحة من مؤسسة MSD لعلوم الحياة ؛ منحة من مؤسسة دايوا للأوراق المالية الصحية ؛ منحة من مؤسسة طوكيو للبحوث الكيميائية الحيوية ؛ منحة أبحاث علوم الحياة من مؤسسة تاكيدا للعلوم؛ ومنحة من مؤسسة SENSHIN للبحوث الطبية.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
