Halvautomatisk isolering af den stromale vaskulære fraktion fra murine hvidt fedtvæv ved hjælp af en vævsdissociator
Summary
Denne protokol beskriver den halvautomatiske isolering af den stromale vaskulære fraktion (SVF) fra murine fedtvæv for at opnå preadipocytter og opnå adipocytdifferentiering in vitro. Brug af en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse reducerer eksperimentel variation og øger reproducerbarheden.
Abstract
In vitro-undersøgelsen af hvid, brun og beige adipocytdifferentiering muliggør undersøgelse af celleautonome funktioner af adipocytter og deres mekanismer. Udødeliggjorte hvide preadipocytcellelinjer er offentligt tilgængelige og meget udbredt. Imidlertid er fremkomsten af beige adipocytter i hvidt fedtvæv som reaktion på eksterne signaler vanskeligt at rekapitulere i fuldt omfang ved hjælp af offentligt tilgængelige hvide adipocytcellelinjer. Isolering af den stromale vaskulære fraktion (SVF) fra murine fedtvæv udføres almindeligvis for at opnå primære preadipocytter og udføre adipocytdifferentiering. Imidlertid kan hakket og kollagenasefordøjelse af fedtvæv i hånden resultere i eksperimentel variation og er tilbøjelig til forurening. Her præsenterer vi en modificeret halvautomatisk protokol, der anvender en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse for at opnå lettere isolering af SVF med det formål at reducere eksperimentel variation, reducere forurening og øge reproducerbarheden. De opnåede preadipocytter og differentierede adipocytter kan anvendes til funktionelle og mekanistiske analyser.
Introduction
Fedtvævsbiologi har tiltrukket sig stadig stigende opmærksomhed på grund af den voksende forekomst af fedme og type 2-diabetes globalt1. Adipocytter opbevarer overskydende energi i form af lipiddråber, som frigives ved sult. Desuden opretholder fedtvæv systemisk energihomeostase ved at tjene som et endokrin organ og kommunikere med andre væv 2,3. Interessant nok er både overskydende fedtvæv (fedme) og fedttab (lipodystrofi) forbundet med insulinresistens og diabetes1. Adipocytter er opdelt i tre typer: hvid, brun og beige1. Hvide adipocytter lagrer hovedsageligt overskydende energi som lipider, mens brune og beige adipocytter spreder energi i form af varme via mitokondrieafkoblingsprotein-1 (Ucp1)1,4. Især beige adipocytter (også kaldet “inducerbare” brune adipocytter) forekommer i hvidt fedtvæv som reaktion på kold eller sympatisk stimulering og udviser genekspressionsmønstre, der overlapper med, men adskiller sig fra dem af “klassiske” brune adipocytter5. For nylig er brune og beige adipocytter blevet forventet som potentielle mål for behandlinger mod fedme og diabetes, der sigter mod at “øge energiafledningen” snarere end at “undertrykke energiindtag”4. Støttende, risikoallelen for FTO fedme variant rs1421085 hos mennesker, som udviser den stærkeste association med højere body mass index (BMI) blandt almindelige varianter 6,7 og udviser forskellige gen-miljø interaktioner8,9, rapporteres at negativt regulere beige adipocytdifferentiering og funktion10. Peroxisom proliferator-aktiveret receptor γ (PPARγ) er kendt som en master transkriptionel regulator af adipogenese og er nødvendig og tilstrækkelig til adipocytdifferentiering11. Transskriptionelle regulatorer, såsom PRD1-BF1-RIZ1 homologt domæne indeholdende 16 (PRDM16), tidlig b-cellefaktor 2 (EBF2) og nuklear faktor I-A (NFIA), er afgørende for brun og beige adipocytdifferentiering og funktion 12,13,14,15,16,17,18. På den anden side kræver hvid adipocyt-genprogrammering transkriptionelle regulatorer, såsom transducinlignende forstærkerprotein 3 (TLE3) og zinkfingerprotein 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro-modelsystemer gør det muligt at udføre molekylære undersøgelser, der har til formål at forbedre forståelsen af den eller de mekanismer, der ligger til grund for adipocytters funktioner og dysfunktioner. Selvom offentligt tilgængelige og udødeliggjorte preadipocytcellelinjer såsom 3T3-L1 og 3T3-F442A eksisterer22,23,24, ville kulturen af primære preadipocytter og differentiering i adipocytter være en mere egnet model til undersøgelse af in vivo adipogenese. Isolering af den stromale vaskulære fraktion (SVF) fra murine fedtvæv er en velkendt metode til opnåelse af primære preadipocytter25,26. Imidlertid kan kollagenasefordøjelse af fedtvæv, som almindeligvis udføres ved hjælp af en bakteriel ryster med et rørstativ, resultere i eksperimentel variation og er tilbøjelig til forurening27,28. Her beskriver vi en alternativ protokol, der bruger en blid magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) vævsdissociator til kollagenasefordøjelse for at opnå lettere isolering af SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en protokol til isolering af SVF fra murine fedtvæv for at opnå preadipocytter og udføre adipocytdifferentiering in vitro. Brugen af en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse reducerede eksperimentel variation, reducerede risikoen for kontaminering og øgede reproducerbarheden. Selvom denne procedure er et kritisk trin inden for den præsenterede protokol, er processen meget automatiseret, og optimering er ikke nødvendig. Afhængigt af musens alder og fedtvævsdepot kan det dog være nød…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Takahito Wada og Saiko Yoshida (University of Tokyo, Tokyo, Japan) for deres eksperimentelle bistand. Dette arbejde blev finansieret af følgende tilskud til Y.H.: forskningsstipendium fra University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bevillingsnummer 19K17976; bevilling til Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) fra Japan Foundation for Applied Enzymology, bevillingsnummer 17F005; bevilling fra Pharmacological Research Foundation; tilskud fra Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; bevilling fra MSD Life Science Foundation; tilskud fra Daiwa Securities Health Foundation; bevilling fra Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research bevilling fra Takeda Science Foundation; og bevilling fra SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
