בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.
Abstract
המחקר במבחנה של התמיינות אדיפוציט לבן, חום ובז’ מאפשר לחקור פונקציות אוטונומיות תאיות של אדיפוציטים ומנגנוניהם. קווי תאים קדם-אדיפוציטיים לבנים אימורטליים זמינים לציבור ונמצאים בשימוש נרחב. עם זאת, הופעתם של אדיפוציטים בצבע בז’ ברקמת השומן הלבן בתגובה לרמזים חיצוניים קשה לשחזר את מלוא ההיקף באמצעות קווי תאי אדיפוציט לבנים הזמינים לציבור. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן מורין מבוצע בדרך כלל כדי להשיג preadipocytes ראשוני ולבצע התמיינות אדיפוציט. עם זאת, טחינה ועיכול collagenase של רקמת שומן ביד יכול לגרום לשינויים ניסיוניים נוטה לזיהום. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי שונה המשתמש בדיסוציאטור רקמות לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF, במטרה להפחית את השונות הניסיונית, להפחית את הזיהום ולהגדיל את יכולת השחזור. ניתן להשתמש בפראדיפוציטים המתקבלים ובאדיפוציטים מובחנים לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים.
Introduction
ביולוגיה של רקמת השומן מושכת תשומת לב הולכת וגוברת בגלל השכיחות הגוברת של השמנת יתר וסוכרת מסוג 2 ברחבי העולם1. אדיפוציטים מאחסנים אנרגיה עודפת בצורה של טיפות שומנים, אשר משתחררים עם רעב. יתר על כן, רקמת השומן שומרת על הומאוסטזיס אנרגיה מערכתית על ידי משמש כאיבר אנדוקריני ותקשורת עם רקמות אחרות 2,3. באופן מסקרן, גם עודף רקמת שומן (השמנת יתר) וגם אובדן שומן (ליפודיסטרופיה) קשורים לתנגודת לאינסולין ולסוכרת1. אדיפוציטים מחולקים לשלושה סוגים: לבן, חום ובז’1. אדיפוציטים לבנים מאחסנים בעיקר אנרגיה עודפת כשומנים, בעוד שאדיפוציטים חומים ובז’ מפזרים אנרגיה בצורה של חום באמצעות חלבון פירוק צימוד מיטוכונדריאלי-1 (Ucp1)1,4. יש לציין כי אדיפוציטים בצבע בז’ (המכונים גם אדיפוציטים חומים “מושרים”) מופיעים ברקמת השומן הלבנה בתגובה לגירוי קר או סימפתטי ומציגים דפוסי ביטוי גנים החופפים אך נבדלים מאלה של אדיפוציטים חומים “קלאסיים”5. לאחרונה, אדיפוציטים חומים ובז’ נחזו כמטרות פוטנציאליות לטיפולים נגד השמנת יתר ונגד סוכרת שמטרתם “לשפר את פיזור האנרגיה” במקום “לדכא את צריכת האנרגיה”4. באופן תומך, אלל הסיכון של וריאנט ההשמנה FTO rs1421085 בבני אדם, אשר מציג את הקשר החזק ביותר עם מדד מסת גוף גבוה יותר (BMI) בקרב וריאנטים נפוצים 6,7 ומציג אינטראקציות גנטיות-סביבתיות שונות 8,9, מדווח לווסת באופן שלילי התמיינות ותפקוד אדיפוציט בז ‘10. Peroxisome proliferator-activated receptor-active receptor γ (PPARγ) ידוע כמווסת שעתוק ראשי של אדיפוגנזה והוא הכרחי ומספיק להתמיינות אדיפוציטים11. וסתי שעתוק, כגון PRD1-BF1-RIZ1 תחום הומולוגי המכיל 16 (PRDM16), גורם תא B מוקדם 2 (EBF2) וגורם גרעיני I-A (NFIA), חיוניים להתמיינות ותפקוד אדיפוציט חום ובז’ 12,13,14,15,16,17,18. מצד שני, תכנות גנים של אדיפוציט לבן דורש מווסתי שעתוק, כגון חלבון משפר דמוי מתמר 3 (TLE3) וחלבון אצבע אבץ 423 (ZFP423)19,20,21.
מערכות מודל במבחנה מאפשרות לבצע מחקרים מולקולריים שמטרתם לשפר את ההבנה של המנגנונים העומדים בבסיס התפקודים והתפקוד הלקוי של אדיפוציטים. למרות שקווי תאים קדם-אדיפוציטיים זמינים לציבור ואימורטליים כגון 3T3-L1 ו- 3T3-F442A קיימים22,23,24, התרבית של קדם-אדיפוציטים ראשוניים והתמיינות לאדיפוציטים תהיה מודל מתאים יותר לחקר אדיפוגנזה in vivo. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן murine היא שיטה ידועה להשגת preadipocytes ראשוני25,26. עם זאת, עיכול collagenase של רקמת שומן, אשר מבוצע בדרך כלל באמצעות שייקר חיידקי עם מדף צינור, יכול לגרום לשונות ניסיונית והוא נוטה לזיהום27,28. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול חלופי המשתמש בדיסוצייאטור רקמה עדין המופעל על ידי מגנטית (MACS) לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, תיארנו פרוטוקול לבידוד של SVF מרקמת שומן מורין כדי לקבל preadipocytes ולבצע התמיינות אדיפוציט במבחנה. השימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז הפחית את השונות הניסיונית, הפחית את הסיכון לזיהום והגדיל את יכולת הרבייה. בעוד הליך זה הוא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול המוצג, התהליך הוא אוטומטי מא?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לטקאהיטו ואדה ולסייקו יושידה (אוניברסיטת טוקיו, טוקיו, יפן) על עזרתם בניסוי. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים לי.ה.: מענק מחקר מתוכנית החוקרים הצעירים המצטיינים של אוניברסיטת טוקיו; האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) KAKENHI מענק סיוע למדענים בתחילת דרכם, מענק מספר 19K17976; מענק ל-Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) מהקרן היפנית לאנזימולוגיה יישומית, מענק מספר 17F005; מענק מהקרן למחקר פרמקולוגי; מענק מקרן הזיכרון Mochida למחקר רפואי ופרמצבטי; מענק מקרן MSD למדעי החיים; מענק מקרן Daiwa Securities Health; מענק מקרן המחקר הביוכימי של טוקיו; מענק מחקר במדעי החיים מקרן טקדה למדע; ומענק מקרן המחקר הרפואי SENSHIN.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
