ऊतक डिस्सोसिएटर का उपयोग करके मुराइन व्हाइट एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश का अर्ध-स्वचालित अलगाव
Summary
यह प्रोटोकॉल प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने और विट्रो में एडिपोसाइट्स भेदभाव प्राप्त करने के लिए मुराइन वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के अर्ध-स्वचालित अलगाव का वर्णन करता है। कोलेजनेस पाचन के लिए ऊतक विघटनकारी का उपयोग प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करता है और प्रजनन क्षमता बढ़ाता है।
Abstract
सफेद, भूरे और बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव का इन विट्रो अध्ययन एडिपोसाइट्स और उनके तंत्र के सेल-स्वायत्त कार्यों की जांच को सक्षम बनाता है। अमर सफेद प्रीडिपोसाइट्स सेल लाइनें सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं और व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं। हालांकि, बाहरी संकेतों के जवाब में सफेद वसा ऊतक में बेज एडिपोसाइट्स का उद्भव सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सफेद एडिपोसाइट्स सेल लाइनों का उपयोग करके पूरी सीमा तक पुन: उत्पन्न करना मुश्किल है। मुराइन वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) का अलगाव आमतौर पर प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने और एडिपोसाइट्स भेदभाव करने के लिए निष्पादित किया जाता है। हालांकि, हाथ से वसा ऊतक के मिनसिंग और कोलेजनेस पाचन के परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक भिन्नता हो सकती है और संदूषण का खतरा होता है। यहां, हम एक संशोधित अर्ध-स्वचालित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने, संदूषण को कम करने और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के उद्देश्य से एसवीएफ के आसान अलगाव को प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज पाचन के लिए एक ऊतक विघटनकारी का उपयोग करता है। प्राप्त प्रीडिपोसाइट्स और विभेदित एडिपोसाइट्स का उपयोग कार्यात्मक और यांत्रिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Introduction
वसा ऊतक जीव विज्ञान विश्व स्तर पर मोटापे और टाइप 2 मधुमेह के बढ़ते प्रसार के कारण लगातार ध्यान आकर्षित कर रहाहै। एडिपोसाइट्स लिपिड बूंदों के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा संग्रहीत करते हैं, जो भुखमरी पर जारी होते हैं। इसके अलावा, वसा ऊतक एक अंतःस्रावी अंग के रूप में सेवा करके और अन्य ऊतकोंके साथ संचार करके प्रणालीगत ऊर्जा होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। दिलचस्प बात यह है कि अतिरिक्त वसा ऊतक (मोटापा) और वसा हानि (लिपोडिस्ट्रॉफी) दोनों इंसुलिन प्रतिरोध और मधुमेह1 से जुड़े हुए हैं। एडिपोसाइट्स को तीन प्रकारों में विभाजित किया गया है: सफेद, भूरा और बेज1। सफेद एडिपोसाइट्स मुख्य रूप से लिपिड के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा को संग्रहीत करते हैं, जबकि भूरे और बेज एडिपोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग प्रोटीन -1 (यूसीपी 1)1,4 के माध्यम से गर्मी के रूप में ऊर्जा को नष्ट करते हैं। विशेष रूप से, बेज एडिपोसाइट्स (जिसे “इंड्यूसेबल” ब्राउन एडिपोसाइट्स भी कहा जाता है) ठंड या सहानुभूति उत्तेजना के जवाब में सफेद वसा ऊतक में दिखाई देते हैं और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जो “शास्त्रीय” ब्राउन एडिपोसाइट्स5 के साथ ओवरलैप होते हैं लेकिन अलग होते हैं। हाल ही में, ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स को “ऊर्जा सेवन को दबाने” के बजाय “ऊर्जा अपव्यय बढ़ाने” के उद्देश्य से एंटी-ओबेसिटी और एंटी-डायबिटीज उपचार के संभावित लक्ष्यों के रूप में अनुमानित किया गया है। सहायक रूप से, मनुष्यों में एफटीओ मोटापा संस्करण आरएस 1421085 का जोखिम एलील, जो सामान्य वेरिएंट 6,7 के बीच उच्च बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) के साथ सबसे मजबूत संबंध प्रदर्शित करता है और विभिन्न जीन-पर्यावरण इंटरैक्शन8,9 प्रदर्शित करता है, को बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव और फ़ंक्शन10 को नकारात्मक रूप से विनियमित करने की सूचना मिली है।. पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़ेरेटर-सक्रिय रिसेप्टर γ (पीपीएआरओ) को एडिपोजेनेसिस के मास्टर ट्रांसक्रिप्शनल नियामक के रूप में जाना जाता है और एडिपोसाइट्स भेदभाव11 के लिए आवश्यक और पर्याप्त है। ट्रांसक्रिप्शनल नियामक, जैसे कि पीआरडी 1-बीएफ 1-आरआईजेड 1 समरूप डोमेन जिसमें 16 (पीआरडीएम 16), प्रारंभिक बी सेल फैक्टर 2 (ईबीएफ 2), और परमाणु कारक आई-ए (एनएफआईए) शामिल हैं, ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव और कार्य 12,13,14,15,16,17,18 के लिए महत्वपूर्ण हैं।. दूसरी ओर, सफेद एडिपोसाइट्स जीन प्रोग्रामिंग को ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों की आवश्यकता होती है, जैसे कि ट्रांसड्यूसिन जैसे एन्हांसर प्रोटीन 3 (टीएलई 3) और जिंक फिंगर प्रोटीन 423 (जेडएफपी 423)19,20,21।
इन विट्रो मॉडल सिस्टम आणविक अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं जिसका उद्देश्य एडिपोसाइट्स के कार्यों और शिथिलता को अंतर्निहित तंत्र (ओं) की समझ में सुधार करना है। यद्यपि सार्वजनिक रूप से उपलब्ध और अमर प्रीएडिपोसाइट्स सेल लाइनें जैसे 3T3-L1 और 3T3-F442A 22,23,24 मौजूद हैं, प्राथमिक प्रीएडिपोसाइट्स की संस्कृति और एडिपोसाइट्स में भेदभाव विवो एडिपोजेनेसिस में अध्ययन के लिए एक अधिक उपयुक्त मॉडल होगा। मुराइन वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) का अलगाव प्राथमिक प्रीएडिपोसाइट्स25,26 प्राप्त करने के लिए एक प्रसिद्ध विधि है। हालांकि, वसा ऊतक का कोलेजनेज पाचन, जो आमतौर पर ट्यूब रैक के साथ एक बैक्टीरियल शेकर का उपयोग करके किया जाता है, प्रयोगात्मक भिन्नता का परिणाम हो सकता है और संदूषण27,28 से ग्रस्त है। यहां, हम एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एसवीएफ के आसान अलगाव को प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज पाचन के लिए एक सौम्य चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) ऊतक विघटनकारी का उपयोग करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमने प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने और विट्रो में एडिपोसाइट्स भेदभाव करने के लिए मुराइन एडीपोज ऊतक से एसवीएफ के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। कोलेजनेस पाचन के लिए एक ऊतक विघटनकारी क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ताकाहितो वाडा और साइको योशिदा (टोक्यो विश्वविद्यालय, टोक्यो, जापान) को उनकी प्रयोगात्मक सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को वाईएच को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था: टोक्यो उत्कृष्ट युवा शोधकर्ता कार्यक्रम विश्वविद्यालय से अनुसंधान अनुदान; जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) प्रारंभिक कैरियर वैज्ञानिकों के लिए काकेन्ही अनुदान-सहायता, अनुदान संख्या 19K17976; जापान फाउंडेशन फॉर एप्लाइड एनज़िमोलॉजी से फ्यूचर डायबिटीज रिसर्च (एफएफडीआर) के फ्रंट रनर के लिए अनुदान, अनुदान संख्या 17एफ005; फार्माकोलॉजिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान; मोचिदा मेमोरियल फाउंडेशन फॉर मेडिकल एंड फार्मास्युटिकल रिसर्च से अनुदान; एमएसडी लाइफ साइंस फाउंडेशन से अनुदान; दाइवा सिक्योरिटीज हेल्थ फाउंडेशन से अनुदान; टोक्यो बायोकेमिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान; टाकेडा साइंस फाउंडेशन से जीवन विज्ञान अनुसंधान अनुदान; और सेनशिन मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान।
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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