Summary

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in vitroで脂肪細胞分化を達成することを説明しています。コラゲナーゼ消化に組織解離剤を使用すると、実験の変動が減少し、再現性が向上します。

Abstract

白色、褐色、ベージュ色の脂肪細胞分化の in vitro 研究により、脂肪細胞の細胞自律機能とそのメカニズムの研究が可能になります。不死化白色前駆脂肪細胞株は公に入手可能であり、広く使用されている。しかし、外部の合図に応答して白色脂肪組織にベージュ色の脂肪細胞が出現することは、公開されている白色脂肪細胞株を使用して完全に再現することは困難です。マウス脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離は、初代前駆脂肪細胞を取得し、脂肪細胞分化を行うために一般的に実行されます。ただし、脂肪組織のミンチおよびコラゲナーゼ消化は、実験上のばらつきをもたらす可能性があり、汚染されやすくなります。ここでは、実験のばらつきを減らし、汚染を減らし、再現性を高めることを目的として、コラゲナーゼ消化に組織解離因子を利用してSVFの分離を容易にする修正された半自動プロトコルを紹介します。得られた前駆脂肪細胞および分化脂肪細胞は、機能的および機構的解析に使用することができる。

Introduction

脂肪組織生物学は、肥満と2型糖尿病の有病率が世界的に増加しているため、ますます注目を集めています1。脂肪細胞は過剰なエネルギーを脂肪滴の形で蓄え、飢餓時に放出されます。さらに、脂肪組織は、内分泌器官として機能し、他の組織と通信することにより、全身エネルギー恒常性を維持する2,3。興味深いことに、過剰な脂肪組織(肥満)と脂肪喪失(脂肪異栄養症)の両方がインスリン抵抗性と糖尿病に関連しています1。脂肪細胞は、白、茶色、ベージュの3つのタイプに分けられます1。白色脂肪細胞は主に脂質として過剰なエネルギーを蓄えますが、褐色脂肪細胞とベージュ脂肪細胞はミトコンドリア脱共役タンパク質-1(Ucp1)を介して熱の形でエネルギーを放散します1,4特に、ベージュ色の脂肪細胞(「誘導性」褐色脂肪細胞とも呼ばれる)は、冷または交感神経刺激に応答して白色脂肪組織に現れ、「古典的な」褐色脂肪細胞と重複するがそれとは異なる遺伝子発現パターンを示す5。近年、褐色やベージュ色の脂肪細胞は、「エネルギー摂取の抑制」ではなく「エネルギー散逸の促進」を目的とした抗肥満・抗糖尿病治療の標的として期待されています4。支持的に、ヒトにおけるFTO肥満変異体rs1421085のリスク対立遺伝子は、一般的な変異体6,7の中でより高いボディマス指数(BMI)と最も強い関連を示し、さまざまな遺伝子-環境相互作用を示す8,9、ベージュ脂肪細胞の分化と機能を負に制御することが報告されています10.ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)は、脂肪生成のマスター転写調節因子として知られており、脂肪細胞の分化に必要かつ十分である11。PRD1-BF1-RIZ1を含む16相同ドメイン(PRDM16)、初期b細胞因子2(EBF2)、核因子I-A(NFIA)などの転写調節因子は、褐色およびベージュ色の脂肪細胞の分化と機能に不可欠です12,13,14,15,16,17,18.一方、白色脂肪細胞遺伝子プログラミングには、トランスデューシン様エンハンサータンパク質3(TLE3)やジンクフィンガータンパク質423(ZFP423)などの転写調節因子が必要です19,20,21。

in vitroモデルシステムにより、脂肪細胞の機能と機能障害の根底にあるメカニズムの理解を深めることを目的とした分子研究を行うことができます。3T3-L1や3T3-F442Aなどの公的に入手可能で不死化された前駆脂肪細胞株は存在しますが22,23,24代前駆脂肪細胞の培養と脂肪細胞への分化は、in vivo脂肪生成を研究するためのより適切なモデルです。マウス脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離は、初代前駆脂肪細胞を得るための周知の方法である25,26。しかしながら、脂肪組織のコラゲナーゼ消化は、チューブラックを備えたバクテリアシェーカーを用いて一般的に行われるが、実験的変動をもたらす可能性があり、汚染されやすい27,28。ここでは、SVFの単離を容易にするために、コラゲナーゼ消化に穏やかな磁気活性化細胞選別(MACS)組織解離剤を使用する代替プロトコルについて説明します。

Protocol

このプロトコルに記載されているすべての動物実験は、東京大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、東京大学の機関ガイドラインに従って実施されました。 1.酵素液および培地の調製 7〜8週齢のマウスの鼠径部白色脂肪組織(右側と左側、約150 mg)の両側と2.5 mLの酵素溶液を解離器のチューブCに入れます。 酵素Dをウシ?…

Representative Results

このプロトコルは、脂肪細胞分化誘導の7日後に完全に分化した脂質を含んだ脂肪細胞を生成します。脂肪細胞の分化の程度は、トリグリセリドおよび脂質のオイルレッドo染色(図1A)、または脂肪生成のマスターレギュレーターであるPpargおよびその標的Fabp4などの脂肪細胞遺伝子のqPCR-RTを用いたmRNA発現解析(図1B)によって評価することができる。<strong class="…

Discussion

ここでは、マウス脂肪組織からSVFを単離して脂肪前駆細胞を取得し、 in vitroで脂肪細胞分化を行うためのプロトコルについて説明する。コラゲナーゼ消化に組織解離剤を使用すると、実験のばらつきが減少し、汚染のリスクが減少し、再現性が向上しました。この手順は提示されたプロトコル内の重要なステップですが、プロセスは高度に自動化されており、最適化は必要ありません?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、和田貴仁と吉田彩子(東京大学、東京、日本)の実験支援に感謝したい。この研究は、Y.H.への以下の助成金によって資金提供されました:東京大学優秀若手研究者プログラムからの研究助成金。日本学術振興会 科研費若手研究, 課題番号 19K17976;日本応用酵素学財団からの将来の糖尿病研究のフロントランナー(FFDR)への助成金、助成金番号17F005;薬理学研究財団からの助成金。持田記念医学薬学研究財団からの助成金。MSDライフサイエンス財団からの助成金。大和証券健康財団からの助成金。東京生化学研究財団からの助成武田薬品科学財団からのライフサイエンス研究助成金。専心医学研究財団からの助成金。

Materials

100 mm dish Corning 430167
12 well plate Corning 3513
60 mm dish IWAKI 3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-105-808 contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm BD falcon #352350
Collagen coated dishes, 100 mm BD #356450
Collagen coated dishes, 60 mm BD #354401
Collagen I Coat Microplate 6 well IWAKI 4810-010
Dexamethasone Wako 041-18861
Dissecting Forceps N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp N/A N/A autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS) N/A N/A
gentleMACS C Tubes Milteny Biotec 130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Humulin R Injection U-100 Eli Lilly 872492
Indomethacin Sigma I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX) Sigma 17018-1G
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019
Neomycin Sulfate Fujifilm 146-08871 
Opti-MEM Invitrogen  31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) Add gene #1780
PBS tablets Takara T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cell biolab RV-101
Polybrene Nacalai Tesque 12996-81
Power Sybr Green Master Mix Applied Biosystems 4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO #FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
Rosiglitazone Wako 180-02653
T3 Sigma T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25200-056

References

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Citer Cet Article
Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M., Yamauchi, T. Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator. J. Vis. Exp. (195), e65265, doi:10.3791/65265 (2023).

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