Detta protokoll beskriver den halvautomatiska isoleringen av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad för att erhålla preadipocyter och uppnå adipocytdifferentiering in vitro. Användning av en vävnadsdissociator för kollagenassmältning minskar experimentell variation och ökar reproducerbarheten.
In vitro-studien av vit, brun och beige adipocytdifferentiering möjliggör undersökning av cellautonoma funktioner hos adipocyter och deras mekanismer. Odödliga vita preadipocytcellinjer är allmänt tillgängliga och används ofta. Framväxten av beige adipocyter i vit fettvävnad som svar på externa signaler är emellertid svår att rekapitulera i full utsträckning med hjälp av allmänt tillgängliga vita adipocytcellinjer. Isolering av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad utförs vanligen för att erhålla primära preadipocyter och utföra adipocytdifferentiering. Malning och kollagenasnedbrytning av fettvävnad för hand kan dock resultera i experimentell variation och är benägen för kontaminering. Här presenterar vi ett modifierat halvautomatiskt protokoll som använder en vävnadsdissociator för kollagenassmältning för att uppnå enklare isolering av SVF, i syfte att minska experimentell variation, minska kontaminering och öka reproducerbarheten. De erhållna preadipocyterna och differentierade adipocyterna kan användas för funktionella och mekanistiska analyser.
Fettvävnadsbiologi har väckt allt större uppmärksamhet på grund av den växande förekomsten av fetma och typ 2-diabetes globalt1. Adipocyter lagrar överflödig energi i form av lipiddroppar, som frigörs vid svält. Dessutom upprätthåller fettvävnad systemisk energihomeostas genom att fungera som ett endokrint organ och kommunicera med andra vävnader 2,3. Intressant nog är både överskott av fettvävnad (fetma) och fettförlust (lipodystrofi) kopplade till insulinresistens och diabetes1. Adipocyter är indelade i tre typer: vit, brun och beige1. Vita adipocyter lagrar huvudsakligen överskottsenergi som lipider, medan bruna och beige adipocyter sprider energi i form av värme via mitokondriell frikopplingsprotein-1 (Ucp1)1,4. I synnerhet förekommer beige adipocyter (även kallade “inducerbara” bruna adipocyter) i vit fettvävnad som svar på kall eller sympatisk stimulering och uppvisar genuttrycksmönster som överlappar men skiljer sig från de “klassiska” bruna adipocyterna5. Nyligen har bruna och beige adipocyter förväntats som potentiella mål för behandlingar mot fetma och diabetes som syftar till att “förbättra energiavledningen” snarare än att “undertrycka energiintaget”4. Stödjande rapporteras riskallelen av FTO-fetmavarianten rs1421085 hos människor, som uppvisar den starkaste kopplingen till högre kroppsmassindex (BMI) bland vanliga varianter 6,7 och uppvisar olika gen-miljöinteraktioner8,9, att negativt reglera beige adipocytdifferentiering och funktion10. Peroxisomproliferatoraktiverad receptor γ (PPARγ) är känd som en mastertranskriptionsregulator för adipogenesis och är nödvändig och tillräcklig för adipocytdifferentiering11. Transkriptionsregulatorer, såsom PRD1-BF1-RIZ1 homolog domän innehållande 16 (PRDM16), tidig b-cellfaktor 2 (EBF2) och kärnfaktor I-A (NFIA), är avgörande för brun och beige adipocytdifferentiering och funktion 12,13,14,15,16,17,18. Å andra sidan kräver programmering av vita adipocytgener transkriptionsregulatorer, såsom transducinliknande förstärkareprotein 3 (TLE3) och zinkfingerprotein 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro-modellsystem möjliggör molekylära studier som syftar till att förbättra förståelsen för mekanismerna bakom adipocyternas funktioner och dysfunktioner. Även om offentligt tillgängliga och odödliga preadipocytcellinjer såsom 3T3-L1 och 3T3-F442A existerar22,23,24, skulle odling av primära preadipocyter och differentiering till adipocyter vara en mer lämplig modell för att studera adipogenes in vivo. Isolering av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad är en välkänd metod för att erhålla primära preadipocyter25,26. Kollagenasnedbrytning av fettvävnad, som vanligtvis utförs med hjälp av en bakteriell shaker med ett rörställ, kan dock resultera i experimentell variation och är benägen att kontaminera27,28. Här beskriver vi ett alternativt protokoll som använder en mild magnetaktiverad cellsortering (MACS) vävnadsdissociator för kollagenassmältning för att uppnå enklare isolering av SVF.
Här beskrev vi ett protokoll för isolering av SVF från murin fettvävnad för att erhålla preadipocyter och utföra adipocytdifferentiering in vitro. Användningen av en vävnadsdissociator för kollagenasuppslutning minskade experimentell variation, minskade risken för kontaminering och ökad reproducerbarhet. Även om denna procedur är ett kritiskt steg inom det presenterade protokollet, är processen mycket automatiserad och optimering behövs inte. Beroende på musens ålder och fettvävnadsdepå kan o…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Takahito Wada och Saiko Yoshida (University of Tokyo, Tokyo, Japan) för deras experimentella hjälp. Detta arbete finansierades av följande bidrag till Y.H.: forskningsbidrag från University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bidragsnummer 19K17976; bidrag till Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) från Japan Foundation for Applied Enzymology, bidragsnummer 17F005; anslag från Stiftelsen för farmakologisk forskning; bidrag från Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; bidrag från MSD Life Science Foundation; bidrag från Daiwa Securities Health Foundation; bidrag från Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research bidrag från Takeda Science Foundation; och bidrag från SENSHIN Medical Research Foundation.
100 mm dish | Corning | 430167 | |
12 well plate | Corning | 3513 | |
60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
PBS tablets | Takara | T900 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
T3 | Sigma | T2877-100mg | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |