Dette papir beskriver protokoller til konstruktion og drift af et køletrin for at immobilisere C. elegans på deres originale dyrkningsplader en masse.
Højopløselige de vivo-mikroskopimetoder kan afsløre subtile oplysninger og fine detaljer inde i modeldyret Caenorhabditis elegans (C. elegans), men kræver stærk dyreimmobilisering for at forhindre bevægelsessløring i billederne. Desværre kræver de fleste nuværende immobiliseringsteknikker en betydelig manuel indsats, hvilket giver billeddannelse i høj opløsning lav gennemstrømning. Immobilisering af C. elegans er stærkt forenklet ved hjælp af en kølemetode, der let kan immobilisere hele populationer direkte på deres dyrkningsplader. Køletrinnet kan etablere og opretholde en lang række temperaturer med en ensartet fordeling på dyrkningspladen. I denne artikel dokumenteres hele processen med at opbygge køletrinnet. Målet er, at en typisk forsker uden problemer kan opbygge et operationelt køletrin i deres laboratorium efter denne protokol. Udnyttelse af køletrinnet efter tre protokoller vises, og hver protokol har fordele for forskellige eksperimenter. Der vises også et eksempel på køleprofil af scenen, når den nærmer sig sin endelige temperatur og nogle nyttige tip til brug af køleimmobilisering.
Højopløselig optisk mikroskopi giver et uundværligt værktøj til at studere in vivo biologiske strukturer på subcellulært niveau. Mange biologiske undersøgelser kræver submikronopløsningsbilleddannelse for at løse subtile anatomiske detaljer, herunder neuronmorfologi 1,2, membranstruktur3,4 og proteinlokalisering 5,6. Et billede i høj opløsning kræver en eksponeringstid på flere millisekunder til sekunder afhængigt af billedbehandlingsmodaliteten og sonden 7,8. For at opnå optimale resultater er det vigtigt omhyggeligt at planlægge og gennemføre mikroskopibaserede eksperimenter. Afgørende for denne indsats er en effektiv dyreforberedelsesmetode, der letter billeddannelse i høj opløsning.
Nematoden C. elegans er en meget anvendt modelorganisme til at studere mange biologiske processer9. Dette lille dyr dyrkes typisk på nematode vækstmedium (NGM) agarplader, og de reproducerer hurtigt ved selvbefrugtning, hvilket gør dem velegnede til store undersøgelser. Deres gennemsigtighed og en bred vifte af mærkningsteknikker tillader ligefrem visualisering af deres interne anatomi10,11. De fine strukturer i C. elegans er ideelle til at studere biologiske processer på subcellulært niveau, såsom neuron regenerering 12, neuron degeneration13 og celledeling14. Sådanne undersøgelser kræver billeddannelse ved submikronopløsning og dyreimmobilisering, der er stærk nok til at forhindre billedsløring. Stærk immobilisering er især afgørende for teknikker, der involverer flere billeder i rum eller tid, såsom 3D-billedstakke (dvs. z-stakke) og time-lapse-billeddannelse. Enhver dyrebevægelse mellem eksponeringerne kan skjule resultatet. For C. elegans involverer stærk immobilisering typisk manuel manipulation af individuelle dyr og montering af dem på dias med et bedøvelsesmiddel15,16. Disse tids- og arbejdskrævende procedurer gør store eksperimenter meget vanskelige. En immobiliseringsstrategi, hvor dyr direkte og reversibelt immobiliseres på deres originale dyrkningsplader, kan muliggøre billeddannelse med høj kapacitet og høj opløsning.
Køling immobilisering af C. elegans er blevet vist i nogle få undersøgelser, men er ikke bredt udnyttet. Det kombineres normalt med en mikrofluidisk enhed for yderligere at fastholde dyr17,18,19. Imidlertid er mikrofluidiske enheder komplekse, kræver betydelig operationel træning og kan ikke let integreres med typiske faste dyrkningsarbejdsgange i C. elegans-eksperimenter. Således anvendes mikrofluidik ikke i vid udstrækning til C. elegans immobilisering. Præsenteret her, i forbindelse med Chung Laboratory’s nylige publikation20, er introduktionen af en ny køleimmobiliseringsmetode ved hjælp af et termoelektrisk køletrin (figur 1) for at løse disse mangler. Med køletrinnet kan en typisk 60 mm polystyrendyrkningsplade køles ned til enhver måltemperatur (T-indstilling) mellem -8 °C og stuetemperatur. Denne kølefasetilgang kan let og reversibelt immobilisere en hel dyrepopulation med minimal brugerindsats, hvilket eliminerer 98% af dyrebehandlingstiden20.
Nedenfor beskrives procedurerne for opbygning af et køletrin fra bunden. Bortset fra bearbejdning af dele og 3D-print forventes hele proceduren at tage 4 timer uden krav om specialværktøj eller ekspertise. Derefter beskrives yderligere tre forskellige kølestrategier med varierende kølehastigheder og brugerbestræbelser på at immobilisere C. elegans på et typisk opretstående mikroskop. Den foretrukne strategi kan afhænge af brugerapplikationen. Protokollerne for disse tre køleimmobiliseringsstrategier er beskrevet detaljeret.
Fremstilling, samling og brug af køletrinnet er vist i dette manuskript. De fleste af komponenterne er hyldevarer, der kan købes online. Nogle komponenter, som kobberpladen og safirvinduet, har brug for en brugerdefineret ordre og kan tage op til 1 måned at fremstille. Andre komponenter, der kan 3D-printes, fremstilles let i de fleste forskningsinstitutioner (supplerende tabel 1). Monteringsprocessen kræver kun få værktøjer og kan hurtigt udføres af en ikke-ekspert på få timer. Således bør de fleste biologiske laboratorier nemt kunne implementere denne enhed.
Køletrinnet og køleimmobiliseringsmetoden har flere væsentlige forbedringer i forhold til eksisterende immobiliseringsmetoder, omhyggeligt beskrevet i den oprindelige publikation20. Kort sagt muliggør afkølingsfasen stærk immobilisering af store populationer af C. elegans i alle aldre, herunder embryoner og dauers, på deres typiske dyrkningsplader under standard mikroskopiarbejdsgange. Det eliminerer behovet for komplekse hardwareopsætninger, som mikrofluidik, samtidig med at det giver en stærkere immobiliseringseffekt. Derudover minimerer det den mulige giftige kemiske eksponering for dyr og forskere, da der ikke anvendes kemikalier, samtidig med at det giver en lignende immobiliseringseffekt. Disse tekniske muligheder muliggør bred anvendelse af denne enhed og tilgang til mange forsøg, der kræver høj opløsning in vivo mikroskopi på et stort antal dyr.
Der er nogle kritiske trin under opbygningen af enheden, herunder al termisk pastaapplikation og det brede bånd til fastgørelse af safirvinduet til bødkerpladen. Den termiske pasta sikrer stærk varmeledningsevne ved at erstatte huller med et materiale med lav termisk modstand. For at opnå den ønskede køleydelse skal pastaen indføres korrekt mellem alle tilstødende / kontaktflader, herunder Peltier-koldoverfladen til kobberpladen, Peltier-den varme overflade til kobberkøleblokken og kobberpladen til safirvinduet. Det brede bånd, der påføres scenen, isolerer kobberpladen for at forhindre opvarmning fra luft og kondens, hvilket fører til rust. Det styrker også forbindelsen mellem safirvinduet og kobberpladen. Således kræver både påføring af termisk pasta og det brede bånd ekstra pleje.
I et faktisk køleimmobiliseringseksperiment afhænger parametrene i dette manuskript, såsom spændinger og tider, af dyrkningspladernes og stadiets specifikke egenskaber, såsom mængden af agar i pladerne, trinets effektivitet og omgivelsestemperatur og fugtighed. I fremtidige modifikationer kan en feedback-controller installeres, som en proportional-integral-derivat (PID), for aktivt at justere spændingsindgangen til køletrinnet for at opnå den ønskede temperatur og stabilisere den.
Der er flere begrænsninger ved denne køletrins immobilisering, omhyggeligt beskrevet i den oprindelige publikation20. Kort sagt immobiliseres dyr, der opdrættes ved forskellige temperaturer, i forskellige grader, hvilket kan kræve ekstra finjustering. Dette nuværende køletrin er heller ikke designet til et omvendt mikroskop. Endvidere kan billeddannelse eller screening på en dyrkningsplade direkte medføre forurening af pladen.
Vi designer nye versioner af køletrinnet, der passer til forskellige billeddannelsesplatforme, herunder sammensatte opretstående mikroskoper og inverterede mikroskoper. Disse nye designs vil muliggøre direkte dyrekøling, immobilisering på kulturplader under billeddannelse på disse platforme. Billeddannelsen på disse køletrin vil bruge lange arbejdsafstandsluftnedsænkningsmål, svarende til den opretstående konfiguration. I dag kan luftnedsænkningsmål have en numerisk blænde på op til 0,9, hvilket giver omkring en opløsning på 300 nm til grøn fluorescensproteinbilleddannelse. Således kunne kombinationen af et nyt køletrin med et mikroskop tillade submikronopløsning fluorescensbilleddannelse rutinemæssigt.
Vi giver også nogle nyttige tip til brug af køletrinnet i henhold til vores erfaring. For eksempel bør enkeltpersoner kontrollere, om der er luftbobler inde i vandkølingsenheden. Luftbobler nedbryder kølingen til Peltiers varme overflade og forringer dermed køletrinnets køleeffektivitet. Hvis der er luftbobler, skal 12 V strømforsyningen tændes for at få vandet til at strømme, og alle komponenter i vandstrømmen skal rystes. Luftbobler kan skylles ud fra fangede områder og udluftes af pumpetanken. Forskere bør sikre, at vandstrømsrøret ikke bøjes eller krydses, når vandkøleenheden samles. Rørbøjning eller krydsning kan forhindre tilstrækkelig vandstrøm og reducere køleeffektiviteten. Rørforbindelser skal være korrekt pasform og tætte. Om nødvendigt kan et blødt rør med en anden diameter bruges i stedet for at sikre tæthed. Indsæt bør ikke anvendes, selvom forbindelsen ikke er tæt nok, da pasta kan indføre træsko under fremtidig brug. Rumfugtigheden påvirker køleydelsen og introducerer kondens og is på køletrinnet. Før du placerer en dyrkningsplade på køletrinnet, anbefales det at bruge et papirvæv til at fjerne kondens eller bruge en køleplade til hurtigt at fjerne is, der er dannet på safirvinduet. Pumpetanken og radiatorventilatorerne kan forårsage små vibrationer i mikroskopet, hvis de arbejder på samme bord. Mikroskopvibrationer slører det erhvervede billede og bør derfor undgås. En pude kan bruges til mekanisk isolering af tanken og radiatoren, eller de kan placeres på et separat nærliggende bord. Køletrinnet kan blive et opvarmningstrin ved at vende den elektriske forbindelse til Peltier.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) for kobberpladebearbejdningen.
12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |