Dette papiret beskriver protokoller for konstruksjon og drift av et kjøletrinn for å immobilisere C. elegans på deres originale dyrkingsplater i massevis.
Høyoppløselige de vivo-mikroskopitilnærminger kan avsløre subtil informasjon og fine detaljer inne i modelldyret Caenorhabditis elegans (C. elegans), men krever sterk dyreimmobilisering for å forhindre bevegelsesuskarphet i bildene. Dessverre krever de fleste nåværende immobiliseringsteknikker betydelig manuell innsats, noe som gir høyoppløselig bildebehandling lav gjennomstrømning. Immobilisering av C. elegans er sterkt forenklet ved å bruke en kjølemetode som lett kan immobilisere hele populasjoner direkte på dyrkingsplater. Kjøletrinnet kan etablere og opprettholde et bredt temperaturområde med en jevn fordeling på dyrkingsplaten. I denne artikkelen er hele prosessen med å bygge kjøletrinnet dokumentert. Målet er at en typisk forsker kan bygge et operativt kjøletrinn i laboratoriet sitt etter denne protokollen uten problemer. Utnyttelse av kjøletrinnet etter tre protokoller vises, og hver protokoll har fordeler for forskjellige eksperimenter. Også vist er et eksempel på kjøleprofil av scenen når den nærmer seg sin endelige temperatur og noen nyttige tips ved bruk av kjøling immobilisering.
Høyoppløselig optisk mikroskopi gir et uunnværlig verktøy for å studere in vivo biologiske strukturer på subcellulært nivå. Mange biologiske studier krever avbildning med submikronoppløsning for å løse subtile anatomiske detaljer, inkludert nevronmorfologi 1,2, membranstruktur3,4 og proteinlokalisering 5,6. Et høyoppløselig bilde krever en eksponeringstid på flere millisekunder til sekunder, avhengig av bildemodaliteten og sonden 7,8. For å oppnå optimale resultater er det viktig å planlegge og gjennomføre mikroskopibaserte eksperimenter nøye. Avgjørende for denne innsatsen er en effektiv dyreforberedelsesmetode som muliggjør høyoppløselig bildebehandling.
Nematoden C. elegans er en mye brukt modellorganisme for å studere mange biologiske prosesser9. Dette lille dyret dyrkes vanligvis på nematodevekstmedium (NGM) agarplater, og de reproduserer raskt ved selvbefruktning, noe som gjør dem godt egnet for store studier. Deres gjennomsiktighet og et bredt spekter av merkingsteknikker tillater enkel visualisering av deres indre anatomi10,11. De fine strukturene i C. elegans er ideelle for å studere biologiske prosesser på subcellulært nivå, som nevronregenerering 12, nevrondegenerasjon13 og celledeling14. Slike studier nødvendiggjør avbildning ved submikronoppløsning og immobilisering av dyr som er sterk nok til å forhindre uskarphet i bildet. Sterk immobilisering er spesielt viktig for teknikker som involverer flere bilder i rom eller tid, for eksempel 3D-bildestakker (dvs. z-stabler) og time-lapse-avbildning. Enhver dyrebevegelse mellom eksponeringene kan skjule resultatet. For C. elegans innebærer sterk immobilisering vanligvis manuell manipulering av individuelle dyr og montering av dem på lysbilder med bedøvelse15,16. Disse tids- og arbeidskrevende prosedyrene gjør storskala eksperimenter svært vanskelige. En immobiliseringsstrategi der dyr direkte og reversibelt immobiliseres på sine originale dyrkingsplater, kan muliggjøre høyoppløselig avbildning med høy gjennomstrømning.
Kjøling immobilisering av C. elegans har blitt vist i noen få studier, men er ikke mye brukt. Det er vanligvis kombinert med en mikrofluidisk enhet for å begrense dyreneytterligere 17,18,19. Imidlertid er mikrofluidiske enheter komplekse, krever betydelig operativ trening, og kan ikke enkelt integreres med typiske faste dyrkingsarbeidsflyter av C. elegans-eksperimenter. Dermed er mikrofluidikk ikke mye brukt for C. elegans immobilisering. Presentert her, i forbindelse med Chung-laboratoriets nylige publikasjon20, er introduksjonen av en ny kjøleimmobiliseringstilnærming ved hjelp av et termoelektrisk kjøletrinn (figur 1) for å løse disse manglene. Med kjøletrinnet kan en typisk 60 mm dyrkingsplate av polystyren kjøles ned til en hvilken som helst måltemperatur (T-sett) mellom -8 °C og romtemperatur. Denne tilnærmingen til kjøletrinn kan lett og reversibelt immobilisere en hel dyrepopulasjon med minimal brukerinnsats, og eliminere 98% av dyrebehandlingstiden20.
Nedenfor beskrives prosedyrene for å bygge et kjøletrinn fra bunnen av. Bortsett fra maskinering av deler og 3D-utskrift, forventes hele prosedyren å ta 4 timer uten krav om spesialverktøy eller ekspertise. Deretter beskrives tre forskjellige kjølestrategier med varierende kjølehastigheter og brukerinnsats for å immobilisere C. elegans på et typisk oppreist mikroskop. Den foretrukne strategien kan avhenge av brukerapplikasjonen. Protokollene for disse tre kjøleimmobiliseringsstrategiene er beskrevet i detalj.
Produksjon, montering og bruk av kjøletrinn er vist i dette manuskriptet. De fleste komponentene er hyllevarer som kan kjøpes online. Noen komponenter, som kobberplaten og safirvinduet, trenger en tilpasset bestilling og kan ta opptil 1 måned å fremstille. Andre komponenter som kan 3D-printes, fremstilles enkelt ved de fleste forskningsinstitusjoner (tilleggstabell 1). Monteringsprosessen trenger bare noen få verktøy og kan raskt gjøres av en ikke-ekspert på noen få timer. Dermed bør de fleste biologiske laboratorier enkelt kunne implementere denne enheten.
Kjøletrinnet og kjøleimmobiliseringstilnærmingen har flere betydelige forbedringer i forhold til eksisterende immobiliseringsmetoder, nøye beskrevet i den opprinnelige publikasjonen20. Kort fortalt muliggjør avkjølingstrinnet sterk immobilisering av store populasjoner av C. elegans i alle aldre, inkludert embryoer og dauer, på deres typiske dyrkningsplater under standard mikroskopiarbeidsflyter. Det eliminerer behovet for komplekse maskinvareoppsett, som mikrofluidikk, samtidig som det gir en sterkere immobiliseringseffekt. I tillegg minimerer det mulig giftig kjemisk eksponering for dyr og forskere siden ingen kjemikalier brukes, samtidig som det gir en lignende immobiliseringseffekt. Disse tekniske egenskapene muliggjør bred anvendelse av denne enheten og tilnærming til mange eksperimenter som krever høy oppløsning in vivo mikroskopi på et stort antall dyr.
Det er noen kritiske trinn under byggingen av enheten, inkludert all termisk pastaapplikasjon og det brede båndet for å feste safirvinduet til cooper-platen. Den termiske pastaen sikrer sterk varmeledningsevne ved å erstatte hull med et materiale med lav termisk motstand. For å oppnå ønsket kjøleytelse må pastaen innføres riktig mellom alle tilstøtende / kontaktflater, inkludert Peltier kald overflate til kobberplaten, Peltier varm overflate til kobberkjøleblokken og kobberplaten til safirvinduet. Det brede båndet som påføres scenen isolerer kobberplaten for å forhindre oppvarming fra luft og kondens, noe som fører til rust. Det styrker også forbindelsen mellom safirvinduet og kobberplaten. Dermed krever både påføring av termisk pasta og det brede båndet ekstra forsiktighet.
I et faktisk avkjølende immobiliseringseksperiment avhenger parametrene gitt i dette manuskriptet, for eksempel spenninger og tider, av de spesifikke egenskapene til dyrkingsplatene og scenen, for eksempel mengden agar i platene, scenens effektivitet og omgivelsestemperatur og fuktighet. I fremtidige modifikasjoner kan en tilbakemeldingskontroller installeres, som en proporsjonal-integral-derivat (PID), for aktivt å justere spenningsinngangen til kjøletrinnet for å oppnå ønsket temperatur og stabilisere den.
Det er flere begrensninger ved denne immobiliseringen av kjøletrinnet, nøye beskrevet i den opprinnelige publikasjonen20. Kort sagt, dyr oppdratt ved forskjellige temperaturer er immobilisert i forskjellige grader, noe som kan trenge ekstra finjustering. Også dette nåværende kjøletrinnet er ikke designet for et omvendt mikroskop. Videre kan avbildning eller screening på en dyrkingsplate direkte introdusere forurensning til platen.
Vi designer nye versjoner av kjøletrinnet som passer for forskjellige bildeplattformer, inkludert sammensatte stående mikroskoper og inverterte mikroskoper. Disse nye designene vil tillate direkte dyrekjøling immobilisering på kulturplater under avbildning på disse plattformene. Avbildningen på disse kjøletrinnene vil bruke langdistanse luftnedsenkingsmål, som ligner på den stående konfigurasjonen. I dag kan luftnedsenkingsmål ha en numerisk blenderåpning på opptil 0,9, noe som gir rundt en oppløsning på 300 nm for grønn fluorescensproteinavbildning. Dermed kan kombinasjonen av et nytt kjøletrinn med et mikroskop tillate submikronoppløsning fluorescensavbildning rutinemessig.
Vi gir også noen nyttige tips for bruk av kjøletrinnet i henhold til vår erfaring. For eksempel bør enkeltpersoner sjekke om det er noen luftbobler inne i vannkjølingsenheten. Luftbobler nedbryter kjølingen til Peltiers varme overflate og forringer dermed kjøletrinnets kjøleeffektivitet. Hvis luftbobler er til stede, bør 12 V strømforsyningen slås på for å få vannstrømmen til å strømme og alle komponentene i vannstrømmen skal ristes. Luftbobler kan spyles ut fra fangede områder og ventileres ut av pumpetanken. Forskere bør sørge for at vannstrømningsslangen ikke bøyes eller krysses ved montering av vannkjølingsenheten. Rørbøyning eller kryssing kan forhindre tilstrekkelig vannstrøm og redusere kjøleeffektiviteten. Rørforbindelser skal være riktig passform og tett. Om nødvendig kan et mykt rør med en annen diameter brukes i stedet for å sikre tetthet. Lim bør ikke brukes, selv om forbindelsen ikke er tett nok, da lim kan introdusere tresko under fremtidig bruk. Luftfuktigheten i rommet påvirker kjøleytelsen og introduserer kondens og is på kjøletrinnet. Før du legger en dyrkingsplate på kjøletrinnet, anbefales det å bruke et papirlommetørkle for å fjerne kondens eller bruke en kjøleribbe for raskt å fjerne is som har dannet seg på safirvinduet. Pumpetanken og radiatorviftene kan forårsake små vibrasjoner i mikroskopet hvis de jobber på samme bord. Mikroskopvibrasjon gjør bildet som er tatt uskarpt og bør derfor unngås. En pute kan brukes til å isolere tanken og radiatoren mekanisk, eller de kan plasseres på et eget bord i nærheten. Kjøletrinnet kan bli et oppvarmingstrinn ved å reversere den elektriske tilkoblingen til Peltier.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) for kobberplatebearbeiding.
12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |