Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont libérés par les neutrophiles en réponse à une infection bactérienne ou à une lésion traumatique des tissus, mais jouent également un rôle dans les maladies auto-immunes et l’inflammation stérile. Ce sont des structures en forme de toile composées de filaments d’ADN double brin, d’histones et de protéines antimicrobiennes. Une fois libérées, les TNE peuvent piéger et tuer les agents pathogènes extracellulaires dans le sang et les tissus. De plus, les TNE participent à la régulation homéostatique en stimulant l’adhésion plaquettaire et la coagulation. Cependant, la production déréglée de TNE a également été associée à diverses maladies, notamment la septicémie ou les maladies auto-immunes, ce qui en fait une cible prometteuse pour une intervention thérapeutique. Outre la microscopie électronique, la visualisation des TNE à l’aide de l’imagerie par immunofluorescence est actuellement l’une des seules méthodes connues pour démontrer les interactions TNE dans les tissus. Par conséquent, diverses méthodes de coloration ont été utilisées pour visualiser les TNE. Dans la littérature, différents protocoles de coloration sont décrits, et nous avons identifié quatre composantes clés présentant une grande variabilité entre les protocoles : (1) les types d’anticorps utilisés, (2) l’utilisation d’agents autoréducteurs, (3) les méthodes de récupération d’antigènes, et (4) la perméabilisation. Par conséquent, les protocoles de coloration par immunofluorescence in vitro ont été systématiquement adaptés et améliorés dans ce travail pour les rendre applicables à différentes espèces (souris, humains) et tissus (peau, intestin, poumon, foie, cœur, disque vertébral). Après la fixation et l’enrobage de paraffine, des profilés de 3 μm d’épaisseur ont été montés sur des lames. Ces échantillons ont été colorés avec des anticorps primaires contre la myéloperoxydase (MPO), l’histone H3 citrullinée (H3cit) et l’élastase neutrophile (NE) selon un protocole de coloration modifié. Les lames ont été colorées avec des anticorps secondaires et examinées à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ. Les résultats ont été analysés à l’aide d’une fiche d’évaluation et les différences ont été enregistrées de manière semi-quantitative.

Nous présentons ici un protocole de coloration NET optimisé adapté à différents tissus. Nous avons utilisé un nouvel anticorps primaire pour colorer H3cit et réduit la coloration non spécifique avec un agent autoréducteur. De plus, nous avons démontré que la coloration NET nécessite une température élevée constante et une manipulation soigneuse des échantillons.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) ont été visualisés pour la première fois par Brinkmann et al. comme une voie de mort cellulaire différente de l’apoptose et de la nécrose en 2004¹. Dans cette voie, les neutrophiles libèrent leur chromatine décondensée dans l’espace extracellulaire pour former de grandes structures en forme de toile recouvertes de protéines antimicrobiennes qui étaient auparavant stockées dans les granules ou le cytosol. Ces protéines antimicrobiennes comprennent l’élastase neutrophile (NE), la myéloperoxydase (MPO) et l’histone citrullinée H3 (H3cit), qui sont couramment utilisées pour la détection indirecte par i....

Protocole

Cette étude a inclus des tissus de souris provenant d’expériences approuvées par l’Administration d’État de Hambourg pour la recherche animale, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hambourg, Allemagne (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Les tissus utilisés étaient des poumons et du côlon de souris provenant d’un modèle septique et de peau brûlée. Nous avons utilisé des souris mâles et femelles âgées de 8 semaines. La directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques a été respectée pour toutes les expériences. Les échantillons humains anonymisés comprenaient des tissus d’entérocolite néonatale, de peau brû....

Résultats

Avant de commencer l’optimisation de notre protocole, nous avons identifié les étapes clés d’une coloration réussie en recherchant dans PubMed des études utilisant des tissus FFPE pour l’immunomarquage des TNE et en comparant leurs protocoles. Les différences de protocole les plus prometteuses ont été identifiées comme les étapes clés de l’optimisation du protocole, tandis que les étapes qui correspondaient pour la plupart les unes aux autres n’ont pas été modifiées (tableau 1).

Discussion

Dans ce travail, nous avons cherché à adapter et à optimiser les protocoles existants pour l’imagerie des TNE à un plus grand nombre de types de tissus, en commençant par le processus de coloration proprement dit. La première étape critique de cette méthode est la sélection des anticorps les plus appropriés. Pour l’EN, nous avons testé un anticorps anti-NE provenant d’un hôte de souris sur des tissus humains, qui n’a montré aucune coloration fiable par rapport à l’EN, provenant d’un hôte lapin. De plus, Thålin et al. ont.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
;   ;	;   ;	;   ;	dilution
Anticorps anti-élastase neutrophile 100µ ; g	abcam	Ab 68672  ;	1:100
Anticorps anti-histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) 100µ ; g	abcam	Ab 5103	1:50
Anticorps anti-myéloperoxydase [2C7] anti-humain 100 µ ; g	abcam	Ab 25989	1:50
Anticorps anti-myéloperoxydase [2D4] anti-souris 50 µ ; g	abcam	Ab 90810	1:50
Logiciel de microscopie Axiovision  ;	Zeiss	4.8.2.
Solution bloquante au sérum d’ânesse (PRÊT À L’EMPLOI) 50ml	GeneTex	® ;
lamelles	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS dilution d’anticorps 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Âne anti lapin AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Âne anti lapin Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Montage Moyen	Invitrogen	00-4958-02
Porte-lames en verre	Roth	H552.1
Humain/Souris MPO Anticorps	R& D Systems	AF 3667  ;	1:20
Stylo hydrophobe	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 et 1:250
MaxBlock Kit de réactifs réducteurs d’autofluorescence (RUO) 100 ml Maxvision		MB-L
Caméra de microscopie	Zeiss	AxioCamHR3
Micro-ondes	Bosch	HMT84M421
souris IgG1 contrôle négatif	Dako	X0931 Aglient	1:50 et 1:5
Normal chèvre Contrôle IgG	R& D Systems	AB-108-C  ;	1:100
PBS Solution saline tamponnée au phosphate (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
Pot de coloration PMP	Roth	2292.2
Anticorps anti-histone recombinant H3 (citrulline R8) 100µ ; g	abcam	Ab 219406	1:100
IgG de lapin recombinant, monoclonal [EPR25A] - Contrôle d’isotype 200µ ; g	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	; 6640
SuperFrost Plus lames	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris solution saline tamponnée (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Bain-marie	Memmert	830476
Cuiseur	à riz à bain d’eaureishunger	RCP-30
Chambre humide	Weckert Labortechnik	600016
Microscope grand champ Zeiss		Axiovert 200M

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