Summary

Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus

Published: August 18, 2023
doi:

Summary

Neutrofila extracellulära fällor (NET) är förknippade med olika sjukdomar, och immunofluorescens används ofta för att visualisera dem. Det finns dock olika färgningsprotokoll, och i många fall undersöks endast en typ av vävnad. Här etablerar vi ett allmänt tillämpligt protokoll för färgning av NET i mus- och mänsklig vävnad.

Abstract

Neutrofila extracellulära fällor (NET) frigörs av neutrofiler som svar på bakterieinfektion eller traumatisk vävnadsskada, men spelar också en roll vid autoimmuna sjukdomar och steril inflammation. De är nätliknande strukturer som består av dubbelsträngade DNA-filament, histoner och antimikrobiella proteiner. När NET väl har släppts ut kan de fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad. Dessutom deltar NET i homeostatisk reglering genom att stimulera trombocytadhesion och koagulation. Men den dysreglerade produktionen av NET har också förknippats med olika sjukdomar, inklusive sepsis eller autoimmuna sjukdomar, vilket gör dem till ett lovande mål för terapeutisk intervention. Förutom elektronmikroskopi är visualisering av NET med hjälp av immunofluorescensavbildning för närvarande en av de enda kända metoderna för att påvisa NET-interaktioner i vävnad. Därför har olika färgningsmetoder för att visualisera NET använts. I litteraturen beskrivs olika färgningsprotokoll, och vi identifierade fyra nyckelkomponenter som visar hög variabilitet mellan protokollen: (1) de typer av antikroppar som används, (2) användningen av autofluorescensreducerande medel, (3) antigenhämtningsmetoder och (4) permeabilisering. Därför har in vitro immunofluorescensfärgningsprotokoll systematiskt anpassats och förbättrats i detta arbete för att göra dem tillämpliga för olika arter (mus, människa) och vävnader (hud, tarm, lunga, lever, hjärta, ryggskiva). Efter fixering och paraffininbäddning monterades 3 μm tjocka sektioner på objektglas. Dessa prover färgades med primära antikroppar för myeloperoxidas (MPO), citrullinerad histon H3 (H3cit) och neutrofil elastas (NE) enligt ett modifierat färgningsprotokoll. Objektglasen färgades med sekundära antikroppar och undersöktes med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Resultaten analyserades enligt ett utvärderingsformulär och skillnader registrerades semikvantitativt.

Här presenterar vi ett optimerat NET-färgningsprotokoll som lämpar sig för olika vävnader. Vi använde en ny primär antikropp för att färga för H3cit och minskade ospecifik färgning med ett autofluorescensreducerande medel. Vidare visade vi att NET-färgning kräver en konstant hög temperatur och noggrann hantering av prover.

Introduction

Neutrofila extracellulära fällor (NET) visualiserades först av Brinkmann et al. som en väg för celldöd som skiljer sig från apoptos och nekros 20041. I denna väg släpper neutrofiler ut sitt dekondenserade kromatin i det extracellulära utrymmet för att bilda stora nätliknande strukturer täckta av antimikrobiella proteiner som tidigare lagrades i granulerna eller cytosolen. Dessa antimikrobiella proteiner inkluderar neutrofilt elastas (NE), myeloperoxidas (MPO) och citrullinerad histon H3 (H3cit), som vanligtvis används för indirekt immunofluorescensdetektion av NET2. Denna metod identifierar inte bara den kvantitativa närvaron av dessa proteiner; Det har faktiskt fördelen att det specifikt detekterar NET-liknande strukturer. I NET samlokaliseras de nämnda proteinerna med extracellulärt DNA, vilket kan detekteras genom en överlappning av fluorescenssignalerna för varje färgat protein och det extracellulära DNA:t. Till skillnad från de överlappande signalerna på grund av extracellulärt DNA och proteinsamlokalisering i NET, visar intakta neutrofiler ingen samlokalisering. Här lagras NET-komponenterna vanligtvis separat i granuler, kärnor och cytosol3.

Sedan den första upptäckten har det visat sig att NET spelar en central roll i många sjukdomar, särskilt de som involverar inflammation. NET visar antimikrobiella funktioner under infektion genom att fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad 4,5. Men NET har också kopplats till autoimmuna sjukdomar och hyperinflammatoriska svar, som systemisk lupus erythematosus, reumatisk artrit och allergisk astma 6,7,8. NET främjar vasoocklusion och inflammation vid åderförkalkning, trombocytvidhäftning och spekuleras spela en roll i metastaserande cancer 9,10,11. Ändå tros de ha antiinflammatoriska egenskaper genom att minska proinflammatoriska cytokinnivåer12. Även om NET blir allt mer intressant inom ett bredare forskningsområde, är en robust NET-detektionsmetod grundläggande för framtida forskning.

Även om visualisering av NET i olika vävnader med hjälp av immunofluorescensavbildning är komplex och kräver anpassning, förutom elektronmikroskopi, är det för närvarande en av de mest kända metoderna för att visualisera interaktionerna mellan NET och celler och används främst i formalinfixerade paraffininbäddade vävnader (FFPE)13,14. Det är dock svårt att jämföra NET-avbildning, eftersom olika laboratorier använder sina egna anpassade protokoll. Dessa protokoll skiljer sig åt i sin användning av antikroppar, antigenhämtning eller permeabiliseringsmetod och är ofta optimerade för en specifik typ av vävnad 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Efter att Brinkmann et al. publicerade den första metodiska studien med immunofluorescensvisualisering av NET i FFPE-vävnad, ville vi optimera detta protokoll för en bredare variation av vävnader och arter15. Dessutom, för att etablera ett brett tillämpligt immunofluorescensprotokoll, testade vi olika modifierade protokoll från studier som använde immunfluorescensmetoder i FFPE-vävnad för att detektera NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Dessutom provade vi en ny H3cit-antikropp för mer specifik extracellulär färgning28. Vår hypotes är att genom att systematiskt anpassa nuvarande färgningsprotokoll till olika arter och vävnader kan in vitro-avbildning förbättras, vilket resulterar i en bättre representation av interaktionen mellan neutrofiler och NET både lokalt och systemiskt.

Protocol

Denna studie inkluderade musvävnader som härrör från experiment som godkänts av Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Vävnaderna som användes var muslunga och tjocktarm från septisk modell samt bränd hud. Vi använde 8 veckor gamla han- och honmöss. Det europeiska direktivet 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål följdes för alla försök. De anonymiserade mänsklig…

Representative Results

Innan vi påbörjade vår protokolloptimering identifierade vi viktiga steg för framgångsrik färgning genom att söka i PubMed efter studier som använde FFPE-vävnad för immunfärgning av NET och jämförde deras protokoll. De mest lovande protokollskillnaderna identifierades som de viktigaste stegen för protokolloptimeringen, medan steg som till största delen överensstämde med varandra inte ändrades (Tabell 1). Tabell 1: PubMed-forskning för FFPE-immunfärg…

Discussion

I detta arbete syftade vi till att anpassa och optimera de befintliga protokollen för avbildning av NET till fler vävnadstyper, med början i själva färgningsprocessen. Det första kritiska steget för denna metod är valet av de mest lämpliga antikropparna. För NE provade vi en NE-antikropp från en musvärd på mänsklig vävnad, som inte visade någon tillförlitlig färgning jämfört med NE från en kaninvärd. Vidare föreslog Thålin et al. H3cit (R8) som en mer specifik antikropp för extracellulär färgni…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning grundades av det tyska forskningssällskapet (BO5534). Vi tackar Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer och PD Dr. Ingo Königs för att de försett oss med prover. Dessutom tackar författarna teamet vid UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) för stöd med immunofluorescensmikroskopin.

Materials

         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders – Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).
check_url/fr/65272?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

View Video