Quantificazione della selettività delle caratteristiche visive del riflesso optocinetico nei topi
Summary
Qui descriviamo un protocollo standard per quantificare il riflesso optocinetico. Combina la stimolazione virtuale del tamburo e la video-oculografia, e consente quindi una valutazione precisa della selettività delle caratteristiche del comportamento e della sua plasticità adattativa.
Abstract
Il riflesso optocinetico (OKR) è un movimento oculare innato essenziale che viene innescato dal movimento globale dell’ambiente visivo e serve a stabilizzare le immagini retiniche. Per la sua importanza e robustezza, l’OKR è stato utilizzato per studiare l’apprendimento visuo-motorio e per valutare le funzioni visive di topi con diversi background genetici, età e trattamenti farmacologici. Qui, introduciamo una procedura per valutare le risposte OKR di topi con testa fissata con elevata precisione. La fissazione della testa può escludere il contributo della stimolazione vestibolare sui movimenti oculari, consentendo di misurare i movimenti oculari innescati solo dal movimento visivo. L’OKR è suscitato da un sistema di tamburi virtuali, in cui un reticolo verticale presentato su tre monitor di computer si sposta orizzontalmente in modo oscillatorio o unidirezionale a velocità costante. Con questo sistema di realtà virtuale, possiamo modificare sistematicamente i parametri visivi come la frequenza spaziale, la frequenza temporale/oscillante, il contrasto, la luminanza e la direzione dei reticoli e quantificare le curve di sintonizzazione della selettività delle caratteristiche visive. La video-oculografia a infrarossi ad alta velocità garantisce una misurazione accurata della traiettoria dei movimenti oculari. Gli occhi dei singoli topi sono calibrati per fornire l’opportunità di confrontare gli OKR tra animali di età, sesso e background genetico diversi. La potenza quantitativa di questa tecnica consente di rilevare i cambiamenti nell’OKR quando questo comportamento si adatta plasticamente a causa dell’invecchiamento, dell’esperienza sensoriale o dell’apprendimento motorio; Pertanto, rende questa tecnica una preziosa aggiunta al repertorio di strumenti utilizzati per indagare la plasticità dei comportamenti oculari.
Introduction
In risposta agli stimoli visivi nell’ambiente, i nostri occhi si muovono per spostare lo sguardo, stabilizzare le immagini retiniche, tracciare bersagli in movimento o allineare le fovee di due occhi con bersagli situati a distanze diverse dall’osservatore, che sono vitali per una corretta visione 1,2. I comportamenti oculomotori sono stati ampiamente utilizzati come modelli attraenti di integrazione sensomotoria per comprendere i circuiti neurali in salute e malattia, almeno in parte a causa della semplicità del sistema oculomotorio3. Controllato da tre paia di muscoli extraoculari, l’occhio ruota nell’alveolo principalmente attorno a tre assi corrispondenti: elevazione e depressione lungo l’asse trasversale, adduzione e abduzione lungo l’asse verticale e intorsione ed estorsione lungo l’asse anteroposteriore 1,2. Un sistema così semplice consente ai ricercatori di valutare i comportamenti oculomotori dei topi in modo semplice e accurato in un ambiente di laboratorio.
Uno dei principali comportamenti oculomotori è il riflesso optocinetico (OKR). Questo movimento oculare involontario è innescato da lente derive o slittamenti di immagini sulla retina e serve a stabilizzare le immagini retiniche mentre la testa di un animale o l’ambiente circostante si muovono 2,4. L’OKR, come paradigma comportamentale, è interessante per i ricercatori per diversi motivi. In primo luogo, può essere stimolato in modo affidabile e quantificato con precisione 5,6. In secondo luogo, le procedure di quantificazione di questo comportamento sono relativamente semplici e standardizzate e possono essere applicate per valutare le funzioni visive di un’ampia coorte di animali7. In terzo luogo, questo comportamento innato è altamente plastico 5,8,9. La sua ampiezza può essere potenziata quando si verificano slittamenti retinici ripetitivi per lungo tempo 5,8,9 o quando il riflesso oculare vestibolare (VOR) del suo partner di lavoro, un altro meccanismo di stabilizzazione delle immagini retiniche innescato dall’input vestibolare2, è compromesso5. Questi paradigmi sperimentali di potenziamento OKR consentono ai ricercatori di svelare le basi del circuito alla base dell’apprendimento oculomotorio.
Due metodi non invasivi sono stati utilizzati principalmente per valutare l’OKR in studi precedenti: (1) video-oculografia combinata con un tamburo fisico 7,10,11,12,13 o (2) determinazione arbitraria dei giri della testa combinata con un tamburo virtuale6,14,15,16. Sebbene le loro applicazioni abbiano fatto scoperte fruttuose nella comprensione dei meccanismi molecolari e circuitali della plasticità oculomotoria, questi due metodi presentano ciascuno alcuni inconvenienti che limitano le loro capacità nell’esaminare quantitativamente le proprietà dell’OKR. In primo luogo, i tamburi fisici, con motivi stampati di strisce o punti bianchi e neri, non consentono cambi facili e rapidi di modelli visivi, il che limita in gran parte la misurazione della dipendenza dell’OKR da alcune caratteristiche visive, come la frequenza spaziale, la direzione e il contrasto delle griglie mobili 8,17. Invece, i test della selettività dell’OKR a queste caratteristiche visive possono beneficiare della stimolazione visiva computerizzata, in cui le caratteristiche visive possono essere convenientemente modificate da una prova all’altra. In questo modo, i ricercatori possono esaminare sistematicamente il comportamento dell’OKR nello spazio dei parametri visivi multidimensionali. Inoltre, il secondo metodo del test OKR riporta solo le soglie dei parametri visivi che innescano OKR distinguibili, ma non le ampiezze dei movimenti oculari o della testa 6,14,15,16. La mancanza di potenza quantitativa impedisce quindi di analizzare la forma delle curve di sintonizzazione e le caratteristiche visive preferite, o di rilevare sottili differenze tra i singoli topi in condizioni normali e patologiche. Per superare le limitazioni di cui sopra, la video-oculografia e la stimolazione visiva virtuale computerizzata sono state combinate per saggiare il comportamento dell’OKR nei recenti studi 5,17,18,19,20. Tuttavia, questi studi pubblicati in precedenza non hanno fornito sufficienti dettagli tecnici o istruzioni dettagliate e, di conseguenza, è ancora difficile per i ricercatori stabilire un tale test OKR per la propria ricerca.
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione la selettività delle caratteristiche visive del comportamento OKR in condizioni fotopiche o scotopiche con la combinazione di video-oculografia e stimolazione visiva virtuale computerizzata. I topi sono fissati alla testa per evitare il movimento oculare evocato dalla stimolazione vestibolare. Una telecamera ad alta velocità viene utilizzata per registrare i movimenti oculari dei topi che osservano le griglie mobili con parametri visivi mutevoli. La dimensione fisica dei bulbi oculari dei singoli topi è calibrata per garantire l’accuratezza della derivazione dell’angolo dei movimenti oculari21. Questo metodo quantitativo permette di confrontare il comportamento OKR tra animali di età o background genetici diversi, o di monitorarne il cambiamento causato da trattamenti farmacologici o dall’apprendimento visuo-motorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo del test comportamentale OKR qui presentato offre diversi vantaggi. In primo luogo, la stimolazione visiva generata dal computer risolve i problemi intrinseci dei tamburi fisici. Affrontando il problema che i tamburi fisici non supportano l’esame sistematico della frequenza spaziale, della direzione o dell’accordatura del contrasto8, il tamburo virtuale consente di modificare questi parametri visivi su base trial-by-trial, facilitando così un’analisi sistematica e quantitativa della sel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Yingtian He per aver condiviso i dati della sintonizzazione della direzione. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione canadese per l’innovazione e del Fondo di ricerca dell’Ontario (progetto CFI/ORF n. 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) e Connaught New Researcher Awards.
Materials
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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