Quantificação da Seletividade Visual do Reflexo Optocinético em Camundongos
Summary
Descrevemos um protocolo padrão para quantificação do reflexo optocinético. Combina estimulação virtual de tambor e vídeo-oculografia, permitindo assim uma avaliação precisa da seletividade característica do comportamento e sua plasticidade adaptativa.
Abstract
O reflexo optocinético (RPO) é um movimento ocular inato essencial que é desencadeado pelo movimento global do ambiente visual e serve para estabilizar as imagens retinianas. Devido à sua importância e robustez, o OKR tem sido utilizado para estudar a aprendizagem visomotora e avaliar as funções visuais de camundongos com diferentes origens genéticas, idades e tratamentos medicamentosos. Aqui, apresentamos um procedimento para avaliar respostas OKR de camundongos com cabeça fixada com alta precisão. A fixação da cabeça pode excluir a contribuição da estimulação vestibular sobre os movimentos oculares, tornando possível mensurar os movimentos oculares desencadeados apenas pelo movimento visual. O OKR é provocado por um sistema de tambor virtual, no qual uma grade vertical apresentada em três monitores de computador flutua horizontalmente de forma oscilatória ou unidirecional a uma velocidade constante. Com este sistema de realidade virtual, podemos alterar sistematicamente parâmetros visuais como frequência espacial, frequência temporal/oscilação, contraste, luminância e direção das grades, e quantificar curvas de sintonia da seletividade de características visuais. A video-oculografia infravermelha de alta velocidade garante a medição precisa da trajetória dos movimentos oculares. Os olhos de camundongos individuais são calibrados para fornecer oportunidades de comparar os OKRs entre animais de diferentes idades, gêneros e origens genéticas. O poder quantitativo dessa técnica permite detectar alterações no OKR quando esse comportamento se adapta plasticamente devido ao envelhecimento, experiência sensorial ou aprendizagem motora; Assim, torna esta técnica um valioso acréscimo ao repertório de ferramentas utilizadas para investigar a plasticidade dos comportamentos oculares.
Introduction
Em resposta aos estímulos visuais do ambiente, nossos olhos se movem para deslocar o olhar, estabilizar imagens retinianas, rastrear alvos em movimento ou alinhar as fóveas de dois olhos com alvos localizados a distâncias diferentes do observador, que são vitais para uma visão adequada 1,2. Comportamentos oculomotores têm sido amplamente utilizados como modelos atrativos de integração sensório-motora para a compreensão dos circuitos neurais na saúde e na doença, pelo menos em parte devido à simplicidadedo sistema oculomotor3. Controlado por três pares de músculos extraoculares, o olho gira no alvéolo primariamente em torno de três eixos correspondentes: elevação e depressão ao longo do eixo transverso, adução e abdução ao longo do eixo vertical e intorção e extorsão ao longo do eixo anteroposterior 1,2. Um sistema tão simples permite que os pesquisadores avaliem os comportamentos oculomotores de camundongos com facilidade e precisão em um ambiente de laboratório.
Um dos principais comportamentos oculomotores é o reflexo optocinético (RPO). Esse movimento ocular involuntário é desencadeado por lentas derivas ou deslizamentos de imagens na retina e serve para estabilizar as imagens retinianas à medida que a cabeça do animal ou seus arredores se movem 2,4. O OKR, como paradigma comportamental, é interessante para os pesquisadores por vários motivos. Primeiro, pode ser estimulada de forma confiável e quantificada com precisão 5,6. Em segundo lugar, os procedimentos de quantificação desse comportamento são relativamente simples e padronizados e podem ser aplicados para avaliar as funções visuais de uma grande coorte deanimais7. Terceiro, esse comportamento inato é altamente plástico 5,8,9. Sua amplitude pode ser potencializada quando deslizamentos repetitivos da retina ocorrem por longotempo5,8,9, ou quando o reflexo vestibular ocular (RVO), outro mecanismo de estabilização das imagens retinianas desencadeado pela entrada vestibular2, está comprometido5. Esses paradigmas experimentais de potenciação de OKR capacitam os pesquisadores a desvendar a base do circuito subjacente à aprendizagem oculomotora.
Dois métodos não invasivos têm sido primariamente utilizados para avaliar a RA em estudos anteriores: (1) video-oculografia combinada com um tambor físico 7,10,11,12,13 ou (2) determinação arbitrária de giros cefálicos combinada com um tambor virtual6,14,15,16. Embora suas aplicações tenham feito descobertas frutíferas na compreensão dos mecanismos moleculares e de circuito da plasticidade oculomotora, esses dois métodos têm algumas desvantagens que limitam seus poderes em examinar quantitativamente as propriedades do OKR. Em primeiro lugar, tambores físicos, com padrões impressos de listras ou pontos em preto e branco, não permitem mudanças fáceis e rápidas de padrões visuais, o que restringe em grande parte a medida da dependência do OKR de certas características visuais, como frequência espacial, direção e contraste de grades em movimento 8,17. Em vez disso, testes da seletividade do OKR a essas características visuais podem se beneficiar da estimulação visual computadorizada, na qual as características visuais podem ser convenientemente modificadas de tentativa para tentativa. Dessa forma, os pesquisadores podem examinar sistematicamente o comportamento do OKR no espaço de parâmetros visuais multidimensionais. Além disso, o segundo método do ensaio de OKR relata apenas os limiares dos parâmetros visuais que desencadeiam as OKRs discerníveis, mas não as amplitudes dos movimentos dos olhos ou da cabeça 6,14,15,16. A falta de poder quantitativo impede, portanto, analisar a forma das curvas de sintonia e as características visuais preferidas, ou detectar diferenças sutis entre camundongos individuais em condições normais e patológicas. Para superar as limitações acima, a video-oculografia e a estimulação visual virtual computadorizada foram combinadas para testar o comportamento do RA em estudos recentes 5,17,18,19,20. No entanto, esses estudos publicados anteriormente não forneceram detalhes técnicos suficientes ou instruções passo a passo e, consequentemente, ainda é um desafio para os pesquisadores estabelecer tal teste OKR para suas próprias pesquisas.
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar precisamente a seletividade de características visuais do comportamento de OKR sob condições fotópicas ou escotópicas com a combinação de vídeo-oculografia e estimulação visual virtual computadorizada. Os camundongos são fixados com a cabeça para evitar o movimento ocular evocado pela estimulação vestibular. Uma câmera de alta velocidade é usada para registrar os movimentos oculares de ratos vendo grades em movimento com parâmetros visuais alterados. O tamanho físico dos globos oculares de camundongos individuais é calibrado para garantir a precisão da derivação do ângulo dos movimentos oculares21. Este método quantitativo permite comparar o comportamento do OKR entre animais de diferentes idades ou origens genéticas, ou monitorar sua alteração causada por tratamentos farmacológicos ou aprendizagem visomotora.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método do ensaio comportamental OKR aqui apresentado apresenta várias vantagens. Primeiro, a estimulação visual gerada por computador resolve os problemas intrínsecos dos tambores físicos. Lidando com a questão de que os tambores físicos não suportam o exame sistemático da sintonia espacial de frequência, direção ou contraste8, o tambor virtual permite que esses parâmetros visuais sejam alterados experimentalmente, facilitando uma análise sistemática e quantitativa da seletividad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Yingtian He por compartilhar dados de ajuste de direção. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Canadense de Inovação e Fundo de Pesquisa de Ontário (CFI/ORF projeto no. 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) e Connaught New Researcher Awards.
Materials
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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