생쥐에서 광동태 반사의 시각적 특징 선택성 정량화
Summary
여기에서는 광동태 반사를 정량화하기 위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 가상 드럼 자극과 비디오 안구 촬영을 결합하여 동작의 특징 선택성과 적응 가소성을 정확하게 평가할 수 있습니다.
Abstract
광동태 반사(OKR)는 시각 환경의 전체적인 움직임에 의해 유발되고 망막 이미지를 안정화하는 역할을 하는 필수적인 타고난 안구 운동입니다. OKR의 중요성과 견고성으로 인해 OKR은 시각 운동 학습을 연구하고 다양한 유전적 배경, 연령 및 약물 치료를 가진 마우스의 시각 기능을 평가하는 데 사용되었습니다. 여기에서는 머리 고정 마우스의 OKR 응답을 높은 정확도로 평가하는 절차를 소개합니다. 머리 고정은 전정 자극이 안구 운동에 미치는 영향을 배제할 수 있으므로 시각적 움직임에 의해서만 유발되는 안구 운동을 측정할 수 있습니다. OKR은 가상 드럼 시스템에 의해 유도되며, 3개의 컴퓨터 모니터에 표시되는 수직 격자가 진동 방식으로 수평으로 또는 일정한 속도로 단방향으로 드리프트됩니다. 이 가상 현실 시스템을 통해 공간 주파수, 시간/진동 주파수, 대비, 휘도 및 격자 방향과 같은 시각적 매개변수를 체계적으로 변경하고 시각적 특징 선택성의 튜닝 곡선을 정량화할 수 있습니다. 고속 적외선 비디오 안과 조영술은 안구 운동의 궤적을 정확하게 측정합니다. 개별 쥐의 눈은 다양한 연령, 성별 및 유전적 배경을 가진 동물 간의 OKR을 비교할 수 있는 기회를 제공하도록 보정됩니다. 이 기술의 정량적 능력을 통해 이 행동이 노화, 감각 경험 또는 운동 학습으로 인해 소성적으로 적응할 때 OKR의 변화를 감지할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 안구 행동의 가소성을 조사하는 데 사용되는 도구 레퍼토리에 귀중한 추가 기능을 제공합니다.
Introduction
환경의 시각적 자극에 반응하여 우리의 눈은 시선을 이동하거나, 망막 이미지를 안정화하거나, 움직이는 표적을 추적하거나, 두 눈의 중심와를 관찰자로부터 서로 다른 거리에 있는 표적과 정렬하기 위해 움직이며, 이는 적절한 시력에 매우 중요합니다 1,2. 안구 운동 행동은 건강과 질병의 신경 회로를 이해하기 위한 감각 운동 통합의 매력적인 모델로 널리 사용되어 왔는데, 이는 적어도 부분적으로는 안구 운동 시스템의 단순성때문이다 3. 세 쌍의 외안근에 의해 조절되는 눈은 주로 횡축을 따라 상승 및 하강, 수직 축을 따라 내전과 외전, 전후 축을 따라 내전과 외전, 1,2. 이러한 간단한 시스템을 통해 연구자들은 실험실 환경에서 쥐의 안구 운동 행동을 쉽고 정확하게 평가할 수 있습니다.
주요 안구 운동 행동 중 하나는 광동태 반사(OKR)입니다. 이 비자발적 안구 운동은 망막의 느린 표류 또는 이미지의 미끄러짐에 의해 유발되며 동물의 머리 또는 그 주변이 움직일 때 망막 이미지를 안정화하는 역할을합니다 2,4. 행동 패러다임으로서의 OKR은 여러 가지 이유로 연구자들에게 흥미롭습니다. 첫째, 안정적으로 자극되고 정확하게 정량화할 수 있습니다 5,6. 둘째, 이러한 행동을 정량화하는 절차는 비교적 간단하고 표준화되어 있으며, 대규모 동물 집단의 시각 기능을 평가하는 데 적용할 수 있다7. 셋째, 이 타고난 행동은 매우 가소적이다 5,8,9. 그 진폭은 반복적인 망막 미끄러짐이 장시간 발생할 때 강화될 수 있다 5,8,9 또는 전정 입력2에 의해 유발되는 망막 이미지를 안정화시키는 또 다른 메커니즘인 작업 파트너인 전정 안구 반사(VOR)가 손상되었을 때 5. OKR 강화에 대한 이러한 실험적 패러다임은 연구자들이 안구 운동 학습의 기초가 되는 회로 기반을 밝힐 수 있도록 합니다.
이전 연구에서 OKR을 평가하기 위해 주로 두 가지 비침습적 방법이 사용되었습니다: (1) 물리적 드럼과 결합된 비디오 안구 조영술(7,10,11,12,13) 또는 (2) 가상 드럼(6,14,15,16)과 결합된 머리 회전의 임의 결정. 그들의 응용 프로그램은 안구 운동 가소성의 분자 및 회로 메커니즘을 이해하는 데 유익한 발견을 했지만 이 두 가지 방법은 각각 OKR의 특성을 정량적으로 검사하는 능력을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 흑백 줄무늬 또는 점의 인쇄 패턴이 있는 물리적 드럼은 시각적 패턴의 쉽고 빠른 변경을 허용하지 않으며, 이는 움직이는 격자의 공간 주파수, 방향 및 대비와 같은 특정 시각적 특징에 대한 OKR의 의존성 측정을 크게 제한합니다 8,17. 대신, 이러한 시각적 특징에 대한 OKR의 선택성 테스트는 시각적 특징을 시도마다 편리하게 수정할 수 있는 컴퓨터화된 시각적 자극의 이점을 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 연구원은 다차원 시각적 매개 변수 공간에서 OKR 동작을 체계적으로 검사할 수 있습니다. 더욱이, OKR 분석의 두 번째 방법은 식별 가능한 OKR을 유발하는 시각적 매개변수의 임계값만 보고하지만 눈 또는 머리 움직임의 진폭은 보고하지 않습니다 6,14,15,16. 따라서 정량적 검정력이 부족하기 때문에 튜닝 곡선의 모양과 선호하는 시각적 특징을 분석하거나 정상 상태와 병리학적 조건에서 개별 마우스 간의 미묘한 차이를 감지할 수 없습니다. 위와 같은 한계를 극복하기 위해 비디오 안구 조영술과 컴퓨터 가상 시각 자극을 결합하여 최근 연구 5,17,18,19,20에서 OKR 행동을 분석했습니다. 그러나 이전에 발표된 이러한 연구는 충분한 기술적 세부 사항이나 단계별 지침을 제공하지 않았기 때문에 연구자가 자신의 연구를 위해 이러한 OKR 테스트를 설정하는 것은 여전히 어렵습니다.
여기에서는 비디오 안구 조영술과 컴퓨터화된 가상 시각 자극의 조합을 통해 포토픽 또는 스코토픽 조건에서 OKR 행동의 시각적 특징 선택성을 정확하게 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 전정 자극에 의해 유발되는 안구 운동을 피하기 위해 머리를 고정합니다. 고속 카메라는 시각적 매개변수가 변경되는 움직이는 격자를 보는 마우스의 안구 움직임을 기록하는 데 사용됩니다. 개별 마우스의 안구의 물리적 크기는 안구 운동의 각도를 유도하는 정확성을 보장하기 위해 보정된다21. 이 정량적 방법을 사용하면 서로 다른 연령 또는 유전적 배경을 가진 동물 간의 OKR 행동을 비교하거나 약리학적 치료 또는 시각 운동 학습으로 인한 변화를 모니터링할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 OKR 행동 분석 방법은 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 컴퓨터로 생성된 시각적 자극은 물리적 드럼의 본질적인 문제를 해결합니다. 물리적 드럼이 공간 주파수, 방향 또는 대비 튜닝8의 체계적인 검사를 지원하지 않는다는 문제를 해결하기 위해 가상 드럼을 사용하면 이러한 시각적 매개변수를 시험별로 변경할 수 있으므로 OKR 동작의 특징 선택성에 대한 체계적…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
방향 조정 데이터를 공유해 주신 Yingtian He에게 감사드립니다. 이 연구는 Canadian Foundation of Innovation 및 Ontario Research Fund(CFI/ORF 프로젝트 번호 37597), NSERC(RGPIN-2019-06479), CIHR(Project Grant 437007) 및 Connaught New Researcher Awards의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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