Modellering av hjärntumörer in vivo med hjälp av elektroporationsbaserad leverans av plasmid-DNA som representerar patientens mutationssignaturer
Summary
Att använda en immunkompetent, autokton tumörmodell som drivs av vanliga patientmutationer för preklinisk testning är avgörande för immunterapeutisk testning. Detta protokoll beskriver en metod för att generera musmodeller av hjärntumörer med hjälp av elektroporationsbaserad leverans av plasmid-DNA som representerar vanliga patientmutationer, vilket ger en exakt, reproducerbar och konsekvent musmodell.
Abstract
Tumörmodeller är avgörande för preklinisk testning av hjärntumörer när det gäller att utforska nya, mer effektiva behandlingar. Med ett stort intresse för immunterapi är det ännu viktigare att ha en konsekvent, kliniskt relevant, immunkompetent musmodell för att undersöka tumör- och immuncellspopulationerna i hjärnan och deras svar på behandling. Medan de flesta prekliniska modeller använder ortotopisk transplantation av etablerade tumörcellinjer, möjliggör modelleringssystemet som presenteras här en “personlig” representation av patientspecifika tumörmutationer i en gradvis, men ändå effektiv utveckling från DNA-konstruktioner som sätts in i delande neurala prekursorceller (NPC) in vivo. DNA-konstruktioner innehåller mosaikanalys med MADR-metoden (dual-recombinase-mediated cassette exchange), vilket möjliggör somatisk mutagenes av drivarmutationer i en kopia. Med hjälp av nyfödda musungar mellan födseln och 3 dagar gamla riktar man in sig på NPC:er genom att dra nytta av dessa delande celler som kantar de laterala ventriklarna. Mikroinjektion av DNA-plasmider (t.ex. MADR-härledda, transposoner, CRISPR-riktat sgRNA) i ventriklarna följs av elektroporering med hjälp av paddlar som omger huvudets rostrala region. Vid elektrisk stimulering tas DNA:t upp i de delande cellerna, med potential att integreras i arvsmassan. Användningen av denna metod har framgångsrikt visats vid utveckling av hjärntumörer hos både barn och vuxna, inklusive den vanligaste elakartade hjärntumören, glioblastom. Den här artikeln diskuterar och demonstrerar de olika stegen för att utveckla en hjärntumörmodell med hjälp av denna teknik, inklusive proceduren för att bedöva unga musvalpar, till mikroinjektion av plasmidblandningen, följt av elektroporering. Med denna autoktona, immunkompetenta musmodell kommer forskare att ha möjlighet att utöka prekliniska modelleringsmetoder i försök att förbättra och undersöka effektiv cancerbehandling.
Introduction
Murina hjärntumörmodeller är avgörande för att förstå mekanismerna för bildning och behandling av hjärntumörer. Nuvarande modeller inkluderar vanligtvis snabbt producerade subkutana eller ortotopiska transplantationer av vanliga tumörcellinjer, baserat på ett begränsat antal drivarmutationer eller patienthärledda xenograftmodeller, med immundefekta möss som hindrar korrekta immunterapistudier 1,2,3,4. Dessutom kan dessa prekliniska resultat leda till falskt positiva resultat, eftersom sådana modeller kan uppvisa dramatiska, ofta botande effekter som svar på behandling, men detta översätts inte till kliniken 2,5,6,7. Att snabbt kunna producera genetiskt modifierade prekliniska musmodeller som bättre återspeglar patientens mutationssignaturer är absolut nödvändigt för att förbättra validiteten av prekliniska resultat.
Elektroporering (EP)-baserad leverans av DNA-plasmider för att inducera mutationer i både funktionsförlust (LOF) och förstärkning av funktion (GOF) möjliggör generering av sådana modeller. Vi utvecklade en metod för en ännu mer exakt representation av GOF-drivrutinsmutationer som kallas mosaikanalys med dual-recombinase-medierat kassettutbyte, eller MADR8. Denna metod gör det möjligt att uttrycka en gen (eller gener) av intresse på ett kontrollerat, lokusspecifikt sätt i somatiska celler8. I kombination med andra molekylära verktyg, såsom clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), kan olika patientmutationer kombineras för att utveckla hjärntumörmodeller hos möss. Denna metod har använts för olika hjärntumörer hos barn, inklusive gliom och ependymom8, samt modeller för hjärntumörer hos vuxna, såsom glioblastom (GBM).
Även om EP-metoden för tumörmodellering inte är lika vanlig som en transplantation, visar följande hittills hur enkelt och reproducerbart detta modelleringssystem är. mTmG-möss används för införande av MADR-plasmid-DNA 8,9. Detta system möjliggör rekombination av loxP- och Flp-rekombinasmålplatser (FRT) belägna på Rosa26-platsen för efterföljande införande av donator-DNA-plasmiden (dvs. GOF-genen av intresse)8,9. Följande protokoll visar hur enkel denna metod är efter flitig övning och förmågan att utveckla modeller av hjärntumörer hos möss på ett inhemskt och konsekvent sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektroporationsbaserad leverans av plasmid-DNA möjliggör in vivo-användning av molekylärbiologi, liknande den som används i genetiskt modifierade musmodeller, men med hastigheten, lokaliseringen och effektiviteten hos viral transduktion 8,13,14. Med det senare kommer dock säkerhetsproblem såväl som immunsvar. Vi har visat i vårt modelleringssystem med EP-leverans av plasmid-DNA att minimalt immunsvar uppstår …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Gi Bum Kim för den immunofluorescerande färgningen och bilderna. Vi tackar också Emily Hatanaka, Naomi Kobritz och Paul Linesch för hjälpsamma råd om protokollet.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
