Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)
Summary
전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.
Abstract
종양 모델은 새롭고 더 효과적인 치료법을 탐색하는 측면에서 뇌종양의 전임상 테스트에 매우 중요합니다. 면역 요법에 대한 관심이 높아짐에 따라 뇌의 종양 및 면역 세포 집단과 치료에 대한 반응을 조사하기 위해 일관되고 임상적으로 적절하며 면역력이 있는 마우스 모델을 보유하는 것이 훨씬 더 중요합니다. 대부분의 전임상 모델은 확립된 종양 세포주의 정형외형 이식을 활용하지만, 여기에 제시된 모델링 시스템은 생체 내에서 분열 신경 전구 세포(NPC)에 삽입된 DNA 구조로부터 점진적이지만 효과적인 개발로 환자 특이적 종양 돌연변이의 “개인화된” 표현을 허용합니다. DNA 구조체는 MADR(dual-recombinase-mediated cassette exchange) 방법을 사용한 모자이크 분석을 특징으로 하며, 드라이버 돌연변이의 단일 복제, 체세포 돌연변이 유발을 허용합니다. 출생부터 생후 3일 사이의 갓 태어난 새끼 쥐를 사용하여 NPC는 측면 심실 내벽을 감싸고 있는 이러한 분열 세포를 이용하여 표적이 됩니다. DNA 플라스미드(예: MADR 유래, 트랜스포손, CRISPR 지향 sgRNA)를 심실에 미세주입한 후 머리의 로스트랄 영역을 둘러싸는 패들을 사용하여 전기천공법을 수행합니다. 전기 자극을 받으면 DNA가 분열하는 세포로 흡수되어 게놈에 통합될 가능성이 있습니다. 이 방법의 사용은 가장 흔한 악성 뇌종양인 교모세포종을 포함한 소아 및 성인 뇌종양 발병에서 성공적으로 입증되었습니다. 이 기사에서는 어린 쥐 새끼를 마취하는 절차부터 플라스미드 혼합물의 미세 주입 및 전기 천공법까지 포함하여 이 기술을 사용하여 뇌종양 모델을 개발하는 다양한 단계에 대해 논의하고 시연합니다. 이 자가적이고 면역력이 있는 마우스 모델을 통해 연구자들은 효과적인 암 치료를 개선하고 조사하기 위한 노력의 일환으로 전임상 모델링 접근 방식을 확장할 수 있습니다.
Introduction
쥐 뇌종양 모델은 뇌종양 형성 및 치료의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 현재 모델에는 일반적으로 적절한 면역요법 연구를 방해하는 면역결핍 마우스를 사용하여 제한된 수의 드라이버 돌연변이 또는 환자 유래 이종이식 모델을 기반으로 일반적으로 사용되는 종양 세포주의 신속하게 생산된 피하 또는 기립성 이식이 포함됩니다 1,2,3,4. 또한, 이러한 전임상 결과는 위양성(false positive)으로 이어질 수 있는데, 이는 이러한 모델이 치료에 대한 반응으로 극적이고 종종 치료 효과를 나타낼 수 있다는 점에서, 그러나 이는 임상에 적용되지 않는다 2,5,6,7. 환자의 돌연변이 시그니처를 더 잘 반영하는 유전자 조작 전임상 마우스 모델을 신속하게 생산할 수 있는 능력은 전임상 결과의 타당성을 개선하는 데 필수적입니다.
LOF(loss of function) 및 GOF(gain of function) 돌연변이를 유도하기 위한 DNA 플라스미드의 전기천공법(EP) 기반 전달은 이러한 모델의 생성을 가능하게 합니다. 우리는 이중 재조합 효소 매개 카세트 교환을 통한 모자이크 분석(mosaic analysis with dual-recombinase-mediated cassette exchange, MADR8)이라고 하는 GOF 드라이버 돌연변이를 훨씬 더 정확하게 표현하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 체세포(somatic cells)에서 제어된, 유전자좌(locus-specific) 방식으로 관심 유전자(또는 유전자들)의 발현을 허용한다8. CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats)과 같은 다른 분자 도구와 함께 다양한 환자 돌연변이를 결합하여 마우스 뇌종양 모델을 개발할 수 있습니다. 이 방법은 신경교종(gliomas)과 뇌실막종(ependymomas8)을 포함한 다양한 소아 뇌종양과 교모세포종(GBM)과 같은 성인 뇌종양 모델에도 사용되어 왔다.
종양 모델링의 EP 방법은 이식만큼 일반적이지는 않지만, 다음은 지금까지 이 모델링 시스템의 용이성과 높은 재현성을 보여줍니다. mTmG 마우스는 MADR-플라스미드 DNA 8,9의 삽입에 사용됩니다. 이 시스템은 Rosa26 유전자좌에 위치한 loxP 및 Flp 재조합 효소 표적(FRT) 부위의 재조합을 허용하여 donor DNA 플라스미드(즉, 관심 GOF 유전자)의 후속 삽입을 가능하게 합니다8,9. 다음 프로토콜은 부지런한 연습 후에 이 방법의 간단성과 자생적이고 일관된 방식으로 마우스 뇌종양 모델을 개발할 수 있는 능력을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달은 유전자 조작 마우스 모델에 사용되는 것과 유사하지만 바이러스 형질도입의 속도, 국소화 및 효율성을 갖춘 분자 생물학의 생체 내 사용을 가능하게 합니다 8,13,14. 그러나 후자의 경우 면역 반응뿐만 아니라 안전 문제도 발생합니다. 플라스미드 DNA의 EP 전달을 이용한 모델링 시…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
면역형광 염색과 영상을 제공해주신 김기범님께 감사드립니다. 또한 프로토콜에 대한 유용한 조언을 해주신 Emily Hatanaka, Naomi Kobritz 및 Paul Linesch에게도 감사드립니다.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
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