Modellering av hjernesvulster in vivo ved bruk av elektroporasjonsbasert levering av plasmid-DNA som representerer pasientens mutasjonssignaturer
Summary
Bruk av en immunkompetent, autoktonøs tumormodell drevet av vanlige pasientmutasjoner for preklinisk testing er kritisk for immunterapeutisk testing. Denne protokollen beskriver en metode for å generere hjernesvulstmusemodeller ved hjelp av elektroporasjonsbasert levering av plasmid-DNA som representerer vanlige pasientmutasjoner, og gir dermed en nøyaktig, reproduserbar og konsistent musemodell.
Abstract
Tumormodeller er kritiske for preklinisk testing av hjernesvulster når det gjelder å utforske nye, mer effektive behandlinger. Med betydelig interesse for immunterapi er det enda mer kritisk å ha en konsistent, klinisk relevant, immunkompetent musemodell for å undersøke svulst- og immuncellepopulasjonene i hjernen og deres respons på behandlingen. Mens de fleste prekliniske modeller benytter ortotopisk transplantasjon av etablerte tumorcellelinjer, tillater modelleringssystemet som presenteres her en “personlig” representasjon av pasientspesifikke tumormutasjoner i en gradvis, men effektiv utvikling fra DNA-konstruksjoner satt inn i delende nevrale forløperceller (NPC) in vivo. DNA-konstruksjoner har mosaikkanalysen med metoden dual-recombinase-mediert kassettutveksling (MADR), som muliggjør enkeltkopi, somatisk mutagenese av drivermutasjoner. Ved å bruke nyfødte musevalper mellom fødsel og 3 dager gammel, blir NPCer målrettet ved å dra nytte av disse delende cellene som fôrer laterale ventrikler. Mikroinjeksjon av DNA-plasmider (f.eks. MADR-avledede, transposoner, CRISPR-rettet sgRNA) i ventriklene etterfølges av elektroporering ved hjelp av padler som omgir rostralområdet av hodet. Ved elektrisk stimulering tas DNA opp i de delende cellene, med potensial for å integreres i genomet. Bruken av denne metoden har blitt demonstrert i utviklingen av både pediatriske og voksne hjernesvulster, inkludert den vanligste ondartede hjernesvulsten, glioblastom. Denne artikkelen diskuterer og demonstrerer de forskjellige trinnene for å utvikle en hjernesvulstmodell ved hjelp av denne teknikken, inkludert prosedyren for bedøvelse av unge musevalper, til mikroinjeksjon av plasmidblandingen, etterfulgt av elektroporering. Med denne autochthonous, immunokompetente musemodellen vil forskere ha muligheten til å utvide prekliniske modelleringsmetoder, i arbeidet med å forbedre og undersøke effektiv kreftbehandling.
Introduction
Murine hjernesvulst modeller er avgjørende for å forstå mekanismene for hjernesvulst dannelse og behandling. Nåværende modeller inkluderer vanligvis raskt produserte subkutane eller ortotopiske transplantasjoner av vanlig brukte tumorcellelinjer, basert på et begrenset antall drivermutasjoner eller pasientavledede xenograftmodeller, ved bruk av immundefekte mus som hindrer riktige immunterapistudier 1,2,3,4. I tillegg kan disse prekliniske resultatene føre til falske positive, ved at slike modeller kan vise dramatiske, ofte kurative effekter som respons på terapi, men dette oversetter ikke til klinikken 2,5,6,7. Å ha evnen til raskt å produsere genetisk konstruerte prekliniske musemodeller som er mer reflekterende for pasientens mutasjonssignaturer, er avgjørende for å forbedre gyldigheten av prekliniske resultater.
Elektroporering (EP) -basert levering av DNA-plasmider for å indusere både tap av funksjon (LOF) og gevinst av funksjon (GOF) mutasjoner tillater generering av slike modeller. Vi utviklet en metode for en enda mer presis representasjon av GOF-drivermutasjoner kalt mosaikkanalyse med dual-recombinase-mediert kassettutveksling, eller MADR8. Denne metoden tillater ekspresjon av et gen (eller gener) av interesse på en kontrollert, locus-spesifikk måte i somatiske celler8. I kombinasjon med andre molekylære verktøy, for eksempel grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR), kan forskjellige pasientmutasjoner kombineres for å utvikle musehjernesvulstmodeller. Denne metoden har blitt brukt til forskjellige pediatriske hjernesvulster, inkludert gliomer og ependymomas8, samt voksne hjernesvulstmodeller, som glioblastom (GBM).
Mens EP-metoden for tumormodellering ikke er like vanlig som en transplantasjon, demonstrerer følgende hittil den enkle og høye reproduserbarheten til dette modelleringssystemet. mTmG-mus brukes til innsetting av MADR-plasmid-DNA 8,9. Dette systemet tillater rekombinasjon av loxP- og Flp-rekombinasemålsteder (FRT) lokalisert ved Rosa26-lokuset for senere innsetting av donor-DNA-plasmidet (dvs. GOF-genet av interesse)8,9. Følgende protokoll demonstrerer enkelheten av denne metoden etter flittig praksis, og evnen til å utvikle mus hjernesvulst modeller på en autochthonous, konsekvent måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektroporasjonsbasert levering av plasmid-DNA tillater in vivo bruk av molekylærbiologi, lik den som brukes i genetisk konstruerte musemodeller, men med hastigheten, lokaliseringen og effektiviteten av viral transduksjon 8,13,14. Med sistnevnte kommer imidlertid sikkerhetsproblemer så vel som immunresponser. Vi har vist i vårt modelleringssystem ved bruk av EP-levering av plasmid-DNA at minimal immunrespons oppstår…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gi Bum Kim for immunfluorescerende farging og bilder. Vi takker også Emily Hatanaka, Naomi Kobritz og Paul Linesch for nyttige råd om protokollen.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
