Effektiv snabb blodperfusion i Xenopus
Summary
Här presenteras ett effektivt snabbt blodperfusionsprotokoll för att förbereda vävnadsprover från afrikanska klogrodor för transkriptomik och proteomikstudier.
Abstract
Xenopus har varit kraftfulla modellorganismer för att förstå ryggradsdjurens utveckling och sjukdom i över 100 år. Här definieras ett snabbt blodperfusionsprotokoll i Xenopus, som syftar till en konsekvent och drastisk minskning av blod i alla vävnader. Perfusion utförs genom att sätta in en nål direkt i hjärtkammaren och pumpa hepariniserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom kärlsystemet. Proceduren kan slutföras på cirka 10 minuter per djur. Blodet domineras av några mycket rikliga proteiner och celltyper, vilket skapar många problem eftersom dessa proteiner maskerar de flesta andra molekyler och celltyper av intresse. Den reproducerbara karakteriseringen av vuxna Xenopus-vävnader med kvantitativ proteomik och encellstranskriptomik kommer att dra nytta av att tillämpa detta protokoll före organprovtagning. Protokollen för vävnadsprovtagning definieras i kompletterande papper. Dessa procedurer syftar till standardisering av praxis över Xenopus av olika kön, ålder och hälsotillstånd, särskilt X. laevis och X. tropicalis.
Introduction
Hela kroppen perfusion av amfibier slutförs rutinmässigt för konservering och fixering 1,2,3,4,5,6. Dessa förfaranden sker dock i en takt som begränsar antalet färska prover som kan tas per djur. Målet med detta arbete är att utveckla ett effektivt blodperfusionsprotokoll i Xenopus och prioritera teknikens hastighet. Protokollet tar mindre än 10 minuter per djur för X. tropicalis och mindre än 15 minuter per X. laevis djur. De sekundära prioriteringarna är enkel replikering och användning av lätt förvärvad utrustning så att högkvalitativa prover kan delas i stor utsträckning mellan Xenopus laboratorier.
Xenopus grodor används i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning för att studera grundläggande biologiska och patologiska processer bevarade över arter. Denna tetrapod har ett närmare evolutionärt förhållande till däggdjur än andra vattenmodeller, med lungor, ett trekammarhjärta och lemmar med siffror. Det internationella samfundet använder effektivt Xenopus för att få en djupare förståelse för mänsklig sjukdom genom djupgående sjukdomsmodellering och molekylär analys av sjukdomsrelaterad genfunktion. De många fördelarna med Xenopus som djurmodell gör dem till ovärderliga verktyg för att studera den molekylära grunden för mänsklig utveckling och sjukdom; Dessa fördelar inkluderar: stor oocyt- och embryostorlek, hög fecunditet, enkel bostad, snabb extern utveckling och enkel genomisk manipulation. Xenopus har uppskattats dela ~ 80% av de identifierade humana sjukdomsgenerna7.
Jämfört med populära däggdjursmodeller är Xenopus en snabb, kostnadseffektiv modell, med lätthet av morpholino knock-down och tillgänglighet av effektiv transgenik och riktade genmutationer med CRISPR8. Kvantitativ masspektrometri och encellstranskriptomik har framgångsrikt tillämpats på Xenopus embryon9,10, men en ny cellatlas från Xenopus laevis visar att sammansättningen av de flesta vävnader domineras av blodcellstyper11. Genom att utveckla en teknik som exsanguinerar vävnad i snabb takt och med hjälp av kylda medier påverkas provets färskhet minimalt av perfusion. Detta är särskilt viktigt för applikationer där målet är att profilera fysiologiskt ostört mRNA eller proteinuttryck.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver traditionella dissektionstekniker för åtkomst till koelomhålan. Andra tekniker är också acceptabla, förutsatt att de orsakar minimal skada på vävnaderna, hjärtat är tillgängligt och lungan och magen är synliga. På samma sätt kan de flesta dissektionsverktyg som listas enkelt ersättas med jämförbara objekt.
Medan försök har gjorts för att optimera effekten av denna procedur, kan resultaten variera beroende på ens erfarenhet och variation mellan ens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH: s OD R24-bidrag OD031956 och NICHD R01-bidrag HD073104. Vi tackar Darcy Kelly för hjälpsamma diskussioner och inledande input om detta protokoll. Vi vill också tacka Samantha Jalbert, Jill Ralston och Wil Ratzan för deras hjälp och stöd samt våra tre anonyma peer reviewers för deras feedback.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologie du développement. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
