Effectieve snelle bloedperfusie bij xenopus
Summary
Hier wordt een effectief protocol voor snelle bloedperfusie gepresenteerd om weefselmonsters van Afrikaanse klauwkikkers voor te bereiden voor transcriptomics- en proteomics-studies.
Abstract
Xenopus zijn al meer dan 100 jaar krachtige modelorganismen voor het begrijpen van de ontwikkeling en ziekte van gewervelde dieren. Hier wordt een snel bloedperfusieprotocol bij Xenopus gedefinieerd, gericht op een consistente en drastische vermindering van bloed in alle weefsels. Perfusie wordt uitgevoerd door een naald rechtstreeks in de ventrikel van het hart in te brengen en gehepariniseerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door het vasculaire systeem te pompen. De procedure kan in ongeveer 10 minuten per dier worden voltooid. Het bloed wordt gedomineerd door een paar zeer overvloedige eiwitten en celtypen, waardoor tal van problemen ontstaan omdat deze eiwitten de meeste andere moleculen en celtypen van belang maskeren. De reproduceerbare karakterisering van volwassen Xenopusweefsels met kwantitatieve proteomica en eencellige transcriptomica zal baat hebben bij de toepassing van dit protocol voorafgaand aan orgaanbemonstering. De protocollen voor weefselbemonstering zijn vastgelegd in begeleidende documenten. Deze procedures zijn gericht op de standaardisatie van praktijken in Xenopus van verschillende geslacht, leeftijd en gezondheidsstatus, met name X. laevis en X. tropicalis.
Introduction
De hele lichaamsperfusie van amfibieën wordt routinematig voltooid met het oog op behoud en fixatie 1,2,3,4,5,6. Deze procedures vinden echter plaats met een snelheid die het aantal verse monsters dat per dier kan worden genomen, beperkt. Het doel van dit werk is om een effectief bloedperfusieprotocol in Xenopus te ontwikkelen, waarbij prioriteit wordt gegeven aan de snelheid van de techniek. Het protocol duurt minder dan 10 min per dier voor X. tropicalis en minder dan 15 min per X. laevis dier. De secundaire prioriteiten zijn het gemak van replicatie en het gebruik van gemakkelijk te verkrijgen apparatuur, zodat hoogwaardige monsters op grote schaal kunnen worden gedeeld tussen Xenopus-laboratoria.
Xenopuskikkers worden veel gebruikt in biomedisch onderzoek om fundamentele biologische en pathologische processen te bestuderen die bewaard zijn gebleven bij verschillende soorten. Deze tetrapode heeft een nauwere evolutionaire relatie met zoogdieren dan andere aquatische modellen, met longen, een hart met drie kamers en ledematen met cijfers. De internationale gemeenschap gebruikt Xenopus effectief om een dieper inzicht te krijgen in menselijke ziekten door middel van diepgaande ziektemodellering en moleculaire analyse van ziektegerelateerde genfunctie. De talrijke voordelen van Xenopus als diermodel maken ze van onschatbare waarde om de moleculaire basis van menselijke ontwikkeling en ziekte te bestuderen; Deze voordelen omvatten: grote eicel- en embryogrootte, hoge vruchtbaarheid, gemak van huisvesting, snelle externe ontwikkeling en gemak van genomische manipulatie. Xenopus deelt naar schatting ~ 80% van de geïdentificeerde menselijke ziektegenen7.
Vergeleken met populaire zoogdiermodellen is Xenopus een snel, kosteneffectief model, met het gemak van morpholino knock-down en beschikbaarheid van efficiënte transgenen en gerichte genmutaties met behulp van CRISPR8. Kwantitatieve massaspectrometrie en eencellige transcriptomica zijn met succes toegepast op Xenopus-embryo’s9,10, maar een recente celatlas van Xenopus laevis laat zien dat de samenstelling van de meeste weefsels wordt gedomineerd door bloedceltypen 11. Door een techniek te ontwikkelen die weefsel in een snel tempo exsanguineert en gekoelde media gebruikt, wordt de versheid van het monster minimaal beïnvloed door perfusie. Dit is vooral belangrijk voor toepassingen waarbij het doel is om fysiologisch onverstoorbaar mRNA of eiwitexpressie te profileren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft traditionele dissectietechnieken voor toegang tot de coelomic holte. Andere technieken zijn ook acceptabel, op voorwaarde dat ze minimale schade aan de weefsels veroorzaken, het hart toegankelijk is en de long en maag zichtbaar zijn. Evenzo kunnen de meeste vermelde dissectietools gemakkelijk worden vervangen door vergelijkbare items.
Hoewel er pogingen zijn gedaan om de werkzaamheid van deze procedure te optimaliseren, kunnen de resultaten variëren, afhankelijk van ie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH’s OD R24 grant OD031956 en NICHD R01 grant HD073104. We danken Darcy Kelly voor de nuttige discussies en de eerste input over dit protocol. We willen ook Samantha Jalbert, Jill Ralston en Wil Ratzan bedanken voor hun hulp en steun, evenals onze drie anonieme peer reviewers voor hun feedback.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologie du développement. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
