Perfusion sanguine rapide efficace chez Xenopus
Summary
Un protocole efficace de perfusion sanguine rapide est présenté ici pour préparer des échantillons de tissus de grenouilles à griffes africaines pour des études transcriptomiques et protéomiques.
Abstract
Les Xénopes sont de puissants organismes modèles pour comprendre le développement des vertébrés et les maladies depuis plus de 100 ans. Ici, un protocole de perfusion sanguine rapide dans Xenopus, visant à une réduction cohérente et drastique du sang dans tous les tissus, est défini. La perfusion est réalisée en insérant une aiguille directement dans le ventricule du cœur et en pompant une solution saline héparinée tamponnée au phosphate (PBS) à travers le système vasculaire. La procédure peut être complétée en environ 10 minutes par animal. Le sang est dominé par quelques protéines et types de cellules très abondants, créant de nombreux problèmes car ces protéines masquent la plupart des autres molécules et types de cellules d’intérêt. La caractérisation reproductible des tissus Xenopus adultes avec la protéomique quantitative et la transcriptomique unicellulaire bénéficiera de l’application de ce protocole avant l’échantillonnage d’organes. Les protocoles d’échantillonnage tissulaire sont définis dans des documents d’accompagnement. Ces procédures visent à normaliser les pratiques chez Xenopus de sexe, d’âge et d’état de santé différents, en particulier X. laevis et X. tropicalis.
Introduction
La perfusion du corps entier des amphibiens est systématiquement complétée à des fins de préservation et de fixation 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces procédures se produisent à un rythme qui limite le nombre d’échantillons frais qui peuvent être prélevés par animal. Le but de ce travail est de développer un protocole de perfusion sanguine efficace chez Xenopus, en priorisant la vitesse de la technique. Le protocole prend moins de 10 minutes par animal pour X. tropicalis et moins de 15 minutes par animal X. laevis. Les priorités secondaires sont la facilité de réplication et l’utilisation d’équipements faciles à acquérir afin que des échantillons de haute qualité puissent être largement partagés entre les laboratoires Xenopus.
Les grenouilles Xenopus sont largement utilisées dans la recherche biomédicale pour étudier les processus biologiques et pathologiques fondamentaux conservés entre les espèces. Ce tétrapode a une relation évolutive plus étroite avec les mammifères que les autres modèles aquatiques, ayant des poumons, un cœur à trois chambres et des membres avec des doigts. La communauté internationale utilise efficacement Xenopus pour mieux comprendre les maladies humaines grâce à une modélisation approfondie des maladies et à une analyse moléculaire de la fonction des gènes liés à la maladie. Les nombreux avantages de Xenopus en tant que modèle animal en font des outils précieux pour étudier la base moléculaire du développement humain et de la maladie; Ces avantages comprennent : une grande taille d’ovocytes et d’embryons, une fécondité élevée, une facilité de logement, un développement externe rapide et une facilité de manipulation génomique. On estime que Xenopus partage ~80% des gènes de maladies humaines identifiés7.
Comparé aux modèles de mammifères populaires, Xenopus est un modèle rapide et rentable, avec la facilité d’élimination du morpholino et la disponibilité de transgéniques efficaces et de mutations génétiques ciblées à l’aide de CRISPR8. La spectrométrie de masse quantitative et la transcriptomique unicellulaire ont été appliquées avec succès aux embryons Xenopus9,10, mais un atlas cellulaire récent de Xenopus laevis montre que la composition de la plupart des tissus est dominée par les types de cellules sanguines 11. En développant une technique qui exsanguine les tissus à un rythme rapide et en utilisant des milieux réfrigérés, la fraîcheur de l’échantillon est peu affectée par la perfusion. Ceci est particulièrement important pour les applications où l’objectif est de profiler l’expression physiologiquement non perturbée de l’ARNm ou de la protéine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit les techniques de dissection traditionnelles pour accéder à la cavité cœlomique. D’autres techniques sont également acceptables, à condition qu’elles causent des dommages minimes aux tissus, que le cœur soit accessible et que les poumons et l’estomac soient visibles. De même, la plupart des outils de dissection énumérés peuvent être facilement remplacés par des éléments comparables.
Bien que des tentatives aient été faites pour optimiser l’efficaci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le OD031956 de subvention OD R24 des NIH et le HD073104 de subvention NICHD R01. Nous remercions Darcy Kelly pour ses discussions utiles et ses premiers commentaires sur ce protocole. Nous tenons également à remercier Samantha Jalbert, Jill Ralston et Wil Ratzan pour leur aide et leur soutien, ainsi que nos trois pairs examinateurs anonymes pour leurs commentaires.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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