Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus
Summary
Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.
Abstract
Xenopus sind seit über 100 Jahren leistungsfähige Modellorganismen für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Hier wird ein schnelles Blutdurchblutungsprotokoll bei Xenopus definiert, das auf eine konsistente und drastische Reduzierung des Blutes in allen Geweben abzielt. Die Perfusion erfolgt durch das Einführen einer Nadel direkt in die Herzkammer und das Pumpen von heparinisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem. Die Prozedur kann in ca. 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Das Blut wird von einigen wenigen Proteinen und Zelltypen dominiert, die sehr häufig vorkommen, was zu zahlreichen Problemen führt, da diese Proteine die meisten anderen Moleküle und Zelltypen von Interesse maskieren. Die reproduzierbare Charakterisierung von adulten Xenopus-Geweben mit quantitativer Proteomik und Einzelzell-Transkriptomik wird von der Anwendung dieses Protokolls vor der Organentnahme profitieren. Die Protokolle für die Gewebeentnahme sind in Begleitpapieren definiert. Diese Verfahren zielen auf die Standardisierung von Praktiken bei Xenopus unterschiedlichen Geschlechts, Alters und Gesundheitszustands ab, insbesondere bei X. laevis und X. tropicalis.
Introduction
Die Ganzkörperperfusion von Amphibien wird routinemäßig zum Zwecke der Konservierung und Fixierung durchgeführt 1,2,3,4,5,6. Diese Verfahren erfolgen jedoch in einem Tempo, das die Anzahl der frischen Proben, die pro Tier entnommen werden können, begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein effektives Blutperfusionsprotokoll in Xenopus zu entwickeln, wobei die Geschwindigkeit der Technik im Vordergrund steht. Das Protokoll dauert weniger als 10 Minuten pro Tier für X. tropicalis und weniger als 15 Minuten pro X. laevis-Tier. Die sekundären Prioritäten sind die einfache Replikation und die Verwendung von leicht zu beschaffenden Geräten, so dass qualitativ hochwertige Proben zwischen den Xenopus-Laboren ausgetauscht werden können.
Xenopus-Frösche werden in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um grundlegende biologische und pathologische Prozesse zu untersuchen, die über Arten hinweg konserviert sind. Dieser Tetrapode hat eine engere evolutionäre Beziehung zu Säugetieren als andere aquatische Modelle, da er Lungen, ein Dreikammerherz und Gliedmaßen mit Fingern hat. Die internationale Gemeinschaft nutzt Xenopus effektiv, um durch eingehende Krankheitsmodellierung und molekulare Analyse der krankheitsbedingten Genfunktion ein tieferes Verständnis menschlicher Krankheiten zu erlangen. Die zahlreichen Vorteile von Xenopus als Tiermodell machen sie zu unschätzbaren Werkzeugen, um die molekularen Grundlagen der menschlichen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zu diesen Vorteilen gehören: große Eizell- und Embryogröße, hohe Fruchtbarkeit, einfache Unterbringung, schnelle äußere Entwicklung und einfache genomische Manipulation. Es wird geschätzt, dass Xenopus ~80% der identifizierten menschlichen Krankheitsgene teilen7.
Im Vergleich zu populären Säugetiermodellen ist Xenopus ein schnelles, kostengünstiges Modell, das sich leicht mit dem Morpholino-Knockdown und der Verfügbarkeit effizienter Transgene und gezielter Genmutationen unter Verwendung von CRISPR8 auszeichnet. Quantitative Massenspektrometrie und Einzelzell-Transkriptomik wurden erfolgreich auf Xenopus-Embryonen angewendet9,10, aber ein aktueller Zellatlas von Xenopus laevis zeigt, dass die Zusammensetzung der meisten Gewebe von Blutzelltypen dominiert wird 11. Durch die Entwicklung einer Technik, die Gewebe schnell ausblutet, und unter Verwendung von gekühlten Medien wird die Probenfrische durch die Perfusion nur minimal beeinträchtigt. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen, bei denen es darum geht, eine physiologisch ungestörte mRNA- oder Proteinexpression zu profilieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt traditionelle Dissektionstechniken für den Zugang zur Zölomhöhle. Andere Techniken sind ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie verursachen nur minimale Schäden am Gewebe, das Herz ist zugänglich und die Lunge und der Magen sind sichtbar. Ebenso können die meisten aufgeführten Sezierwerkzeuge leicht durch vergleichbare Gegenstände ersetzt werden.
Obwohl versucht wurde, die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu optimieren, können die Ergebnisse je nach Erfahrung…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den OD R24 Grant OD031956 und den NICHD R01 Grant HD073104 unterstützt. Wir danken Darcy Kelly für hilfreiche Diskussionen und erste Anregungen zu diesem Protokoll. Wir möchten uns auch bei Samantha Jalbert, Jill Ralston und Wil Ratzan für ihre Hilfe und Unterstützung sowie bei unseren drei anonymen Peer-Reviewern für ihr Feedback bedanken.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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