Summary
Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.
Abstract
Xenopus têm sido poderosos organismos modelo para entender o desenvolvimento de vertebrados e doenças por mais de 100 anos. Aqui, um protocolo de perfusão sanguínea rápida em Xenopus, visando uma redução consistente e drástica do sangue dentro de todos os tecidos, é definido. A perfusão é realizada inserindo uma agulha diretamente no ventrículo do coração e bombeando solução salina tamponada com fosfato heparinizado (PBS) através do sistema vascular. O procedimento pode ser concluído em aproximadamente 10 min por animal. O sangue é dominado por algumas proteínas e tipos celulares altamente abundantes, criando inúmeros problemas, pois essas proteínas mascaram a maioria das outras moléculas e tipos celulares de interesse. A caracterização reprodutível de tecidos adultos de Xenopus com proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única se beneficiará da aplicação deste protocolo antes da amostragem de órgãos. Os protocolos para amostragem de tecidos são definidos em artigos complementares. Esses procedimentos visam à padronização de práticas entre Xenopus de diferentes sexos, idades e estados de saúde, especificamente X. laevis e X. tropicalis.
Introduction
A perfusão de corpo inteiro dos anfíbios é rotineiramente completada para fins de preservação e fixação 1,2,3,4,5,6. No entanto, esses procedimentos ocorrem a uma taxa que limita o número de amostras frescas que podem ser coletadas por animal. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo de perfusão sanguínea efetivo em Xenopus, priorizando a velocidade da técnica. O protocolo leva menos de 10 min por animal para X. tropicalis e menos de 15 min por animal X. laevis. As prioridades secundárias são a facilidade de replicação e o uso de equipamentos de fácil aquisição para que amostras de alta qualidade possam ser amplamente compartilhadas entre os laboratórios Xenopus.
As rãs Xenopus são amplamente utilizadas em pesquisas biomédicas para estudar processos biológicos e patológicos fundamentais conservados entre espécies. Este tetrápode tem uma relação evolutiva mais próxima com os mamíferos do que outros modelos aquáticos, tendo pulmões, um coração de três câmaras e membros com dedos. A comunidade internacional usa efetivamente o Xenopus para obter uma compreensão mais profunda da doença humana por meio de modelagem profunda da doença e análise molecular da função gênica relacionada à doença. As inúmeras vantagens do Xenopus como modelo animal os tornam ferramentas inestimáveis para estudar as bases moleculares do desenvolvimento humano e das doenças; Essas vantagens incluem: grande tamanho do ovócito e do embrião, alta fecundidade, facilidade de alojamento, rápido desenvolvimento externo e facilidade de manipulação genômica. Estima-se que o Xenopus compartilhe ~80% dos genes de doenças humanas identificados7.
Em comparação com modelos populares de mamíferos, o Xenopus é um modelo rápido e econômico, com a facilidade de knock-down de morfolinos e disponibilidade de transgênicos eficientes e mutações gênicas direcionadas usando CRISPR8. A espectrometria quantitativa de massas e a transcriptômica unicelular têm sido aplicadas com sucesso em embriões de Xenopus9,10, mas um atlas celular recente de Xenopus laevis mostra que a composição da maioria dos tecidos é dominada pelos tipos de células sanguíneas 11. Ao desenvolver uma técnica que exsanguina o tecido em um ritmo rápido e usando meios refrigerados, o frescor da amostra é minimamente afetado pela perfusão. Isso é particularmente importante para aplicações onde o objetivo é traçar o perfil fisiologicamente não perturbado do RNAm ou da expressão de proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve as técnicas tradicionais de dissecção para acesso à cavidade celômica. Outras técnicas também são aceitáveis, desde que causem danos mínimos aos tecidos, o coração seja acessível e o pulmão e o estômago sejam visíveis. Da mesma forma, a maioria das ferramentas de dissecção listadas pode ser facilmente substituída por itens comparáveis.
Embora tenham sido feitas tentativas para otimizar a eficácia desse procedimento, os resultados podem variar depend…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo OD031956 de concessão OD R24 do NIH e pelo HD073104 de concessão NICHD R01. Agradecemos a Darcy Kelly pelas discussões úteis e contribuições iniciais sobre este protocolo. Também gostaríamos de agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan por sua assistência e apoio, bem como aos nossos três revisores anônimos por seus comentários.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologie du développement. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
