Optimierung der Aufzucht keimfreier Wespen

Summary

Nasonia-Wespenembryonen wurden nach 12-24 h Parasitierung von Lucillia sericata-Puppen präpariert und mit Alkohol und 10%iger Natriumhypochloritlösung gewaschen, um keimfreie Embryonen zu erhalten. Nach der Aufzucht der keimfreien Embryonen und der Versorgung mit Nasonia-Aufzuchtmedium zum Wachsen und Entwickeln in vitro wurden keimfreie Nasonia-Imagines erhalten.

Abstract

Die aseptische Aufzuchttechnologie ist eine Methode zur Kultivierung von Insekten unter sterilen oder nahezu sterilen Bedingungen, die den Einfluss externer Mikroorganismen auf die Insektenmikrobiota effektiv eliminieren und so die schnelle Entwicklung der Insektenmikrobiota-Forschung fördern kann. Nasonia (Wespengattung) ist ein parasitäres Wespeninsekt, das viele Vorteile hat, wie z.B. eine kurze Lebensdauer, hohe genetische Variation, einfache Bedienung usw., und als Insektenmodellsystem weit verbreitet ist. Im Gegensatz zur Antibiotikabehandlung, die nur die Anzahl der Mikroorganismen bei Tieren reduzieren kann, können aseptische Aufzuchttechniken sowohl die Zusammensetzung als auch die Menge der Mikroorganismen in Tieren kontrollieren, was die Untersuchung von Wirt-Mikroben-Interaktionen weiter erleichtert. Frühere Versionen des Nasonia-Aufzuchtmediums (NRM) weisen jedoch einige Mängel und Probleme auf, wie z. B. einen komplexen und zeitaufwändigen Zubereitungsprozess, eine leichte Kontamination durch Bakterien oder Pilze und eine kurze Lagerzeit. Daher löst diese Studie diese Probleme, indem sie die im NRM-Vorbereitungsprozess verwendeten Werkzeuge, die Lagerbedingungen und die Komponentenverhältnisse optimiert. Das optimierte Medium könnte eine Lagerung bei -20 °C für mindestens 3 Monate ermöglichen und die Möglichkeit einer NRM-Kontamination bei der Fütterung steriler Wespen ausschließen. Dies verbessert die Überlebensrate und das Gesundheitsniveau von aseptischem Nasonia weiter, was wichtig ist, um Nasonia als Modell für die mikrobielle Forschung zu nutzen.

Introduction

Keimfreie Tiere sind Tiere, die keine nachweisbaren lebenden Mikroorganismen und Parasiten^{aufweisen 1}. Keimfreie Embryonen können gewonnen werden, indem die Mutter unter aseptischen Bedingungen präpariert und anschließend in Barrieresystemen aufgezogen wird². Solche Tiere können verwendet werden, um die Auswirkungen von Mikroorganismen auf Tiere zu untersuchen, z. B. auf die Darmmikrobiota, das Immunsystem und den Stoffwechsel¹. Mit bestimmten technischen Mitteln können viele Insekten und sogar Säugetiere unfruchtbar gemacht werden ^3,4. Keimfreie Tiere spielen eine einzigartige Rolle und werden in verschiedenen Aspekten der mikrobiologischen Forschung eingesetzt⁵. So hat beispielsweise der Einsatz von keimfreien Nasonia-Wespen gezeigt, dass Mikroorganismen Wirten helfen können, sich unter langfristigem exogenem Umweltstress an neue Umgebungen anzupassen ^6,7.

Nasonia-Parasitoide sind kleine Schlupfwespen, die ihre Eier in die Puppen von Fliegen injizieren⁴. Es gibt vier bekannte Arten von Nasonia, darunter Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti und Nasonia oneida⁸. N. vitripennis kommt weltweit vor, während die anderen drei Arten nur begrenzte Verbreitungsgebiete in Nordamerika haben⁴. Nasonia-Schlupfwespen gelten aufgrund ihrer Eigenschaften wie einfache Kultivierung, kurzer Fortpflanzungszyklus, sequenziertes Genom und Langzeitdiapause als ideale Modellinsekten ^8,9. Sie können verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Evolution, Genetik, Entwicklung, des Verhaltens und der Symbiose von Insekten zu untersuchen¹⁰. Darüber hinaus können Nasonia-Schlupfwespen auch dazu beitragen, schädliche Fliegen in der Landwirtschaft und Krankheiten zu bekämpfen¹¹. Die erfolgreiche Etablierung eines sterilen Insektensystems umfasst zwei Hauptschritte: (1) die Sterilisation der Embryonen und (2) die Versorgung der Larven mit steriler Nahrung in vitro. Um steriles Futter zu erhalten, entwickelten Brucker und Bordenstein 12 im Jahr 2012 das Nasonia-Aufzuchtmedium (NRMv1), indem sie Chemikalien wie Antibiotika, Bleichmittel und fötales Kälberserum einsetzten, um Bakterien abzutöten¹². Die chemische Sterilisationsmethode führte jedoch zu niedrigen Überlebens- und Eklosionsraten von N. vitripennis¹³. Im Jahr 2016 entwickelten Shropshire et al. dann NRMv2, indem sie eine Filtersterilisationsmethode anstelle einer chemischen Sterilisationsmethode verwendeten, um die Gefahren von Antibiotika und anderen Substanzen zu eliminieren, und optimierten den Züchtungsprozess¹³. Leider hat diese Methode immer noch einige Nachteile, wie z. B. die Herausforderungen, die mit der Vorbereitung und Verwendung des Mediums verbunden sind, sowie die Risiken des Ertrinkens, der Unterernährung oder der Dehydrierung für die Embryonen, Larven und geschlossenen Puppen¹⁴. Wang und Brucker¹⁴ haben kürzlich die Protokolle Nasonia Aufzuchtmedien Version 3 (NRMv3) und die keimfreie Aufzucht Version 2 (GFRv2) verbessert. Diese Verbesserungen reduzierten die Kosten und den Medienverbrauch. Der NRMv3 hat jedoch eine sehr kurze Lagerzeit und ist sehr anfällig für Verunreinigungen.

Aufbauend auf NRMv3 wurden in dieser Studie die Lagerungsmethode und das Nährstoffverhältnis des NRM-Präparationswerkzeugs optimiert. Diese methodische Verfeinerung ermöglicht es, N. vitripennis als Modell für Mikrobiomstudien zu verwenden. Im Vergleich zu dem von Wang et al.14 entwickelten NRMv3 verbessert das verbesserte Werkzeug zum Auspressen von Sarcophaga bullata-Puppen, einem der NRM-Rohstoffe, die Produktionseffizienz von S. bullata-Puppengewebeflüssigkeit im Vergleich zu der von Wang et ^al.14 verwendeten 60-ml-Spritze mit einem Bodenloch erheblich. Wir passten das Nährstoffverhältnis von NRM an, was zu einer gewissen Erhöhung der Überlebensrate von keimfreien Nasonia-Wespen führte, ohne ihre Entwicklungszeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde das NRM in Zentrifugenröhrchen mit kleinem Fassungsvermögen (1,5 ml) verpackt und in einem Kühlschrank bei -20 °C eingefroren, um die Lagerzeit zu verlängern. Es ist erwähnenswert, dass wir zwar die Stubenfliege Lucilia sericata als Wirt und Quelle für die NRM-Präparation verwendet haben, dieses Protokoll jedoch wahrscheinlich für andere Nasonia-Wirte, die im Labor verfügbar sind, angepasst werden kann.

Protocol

1. Aufbereitung von keimfreiemNasonia-Aufzuchtmedium  Legen Sie die handelsüblichen L. sericata-Puppen (siehe Materialtabelle) auf eine Oberfläche, die alle Puppen aufnehmen kann, z. B. ein Tablett oder ein Blatt Papier. Entsorgen Sie unterentwickelte Larven, dunkle alte Puppen, leere Puppenschalen, Sägemehl oder andere Verunreinigungen. Behalten Sie nur junge, bräunlich-rot gefärbte Puppen und geben Sie sie in einen Becher (ca. 3.000-4….

Representative Results

Die Präparationseffizienz von NRM wurde durch die Verbesserung der Präparationswerkzeuge erheblich verbessert. Darüber hinaus wurde das Problem der NRM-Verschmutzung im Fütterungsprozess durch die Optimierung der Strategie und der Konservierungsmethode beseitigt. Gleichzeitig hatte die adjustierte NRM ein geeigneteres Nährstoffverhältnis für das Wachstum und die Entwicklung keimfreier Wespen mit L. sericata als Wirt. Die Überlebensrate keimfreier Wespen von der Larve bis zur Puppe war im Vergleich zu kei…

Discussion

Mit der Anwendung von Hochdurchsatz-Nachweistechnologien wie Genomik und Metabolomik haben Forscher allmählich erkannt, dass es in der Darmmikrobiota eine enorme genetische Vielfalt und metabolische Komplexität gibt¹⁶. Diese symbiotischen Bakterien stehen in engem Zusammenhang mit verschiedenen physiologischen oder pathologischen Zuständen wie dem Ernährungsstoffwechsel des Wirts, Tumoren, Immunität und Alterung durch komplexe Interaktionen mit dem Wirt¹⁷. Die Erforsch…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56