Kroniske sår som er resistente mot antibiotika er en stor trussel mot helsevesenet. Biofilminfeksjoner er gjenstridige og fiendtlige og kan forårsake mangelfull funksjonell sårlukking. Vi rapporterer en klinisk relevant svinemodell av biofilminfiserte kroniske sår i full tykkelse. Denne modellen er kraftig for mekanistiske studier så vel som for testing av intervensjoner.
Biofilminfeksjon er en stor bidragsyter til sårkronisitet. Etablering av klinisk relevant eksperimentell sårbiofilminfeksjon krever involvering av vertsimmunsystemet. Iterative endringer i verten og patogenet under dannelsen av slik klinisk relevant biofilm kan bare forekomme in vivo. Svinesårmodellen er anerkjent for sine fordeler som en kraftig preklinisk modell. Det er flere rapporterte tilnærminger for å studere sårbiofilm. In vitro og ex vivo systemer er mangelfulle når det gjelder vertens immunrespons. Kortvarige in vivo studier involverer akutte responser og tillater derfor ikke modning av biofilm, som er kjent for å forekomme klinisk. Den første langsiktige biofilmstudien av svin ble rapportert i 2014. Studien anerkjente at biofilminfiserte sår kan lukke som bestemt av planimetri, men hudbarrierefunksjonen til det berørte stedet kan ikke gjenopprettes. Senere ble denne observasjonen validert klinisk. Begrepet funksjonell sårlukking ble dermed født. Lukkede sår, men mangelfull hudbarrierefunksjon, kan betraktes som usynlige sår. I dette arbeidet søker vi å rapportere de metodiske detaljene som er nødvendige for å reprodusere den langsiktige svinemodellen for biofilminfisert alvorlig brannskade, som er klinisk relevant og har translasjonsverdi. Denne protokollen gir detaljert veiledning om å etablere en 8 ukers sårbiofilminfeksjon ved bruk av P. aeruginosa (PA01). Åtte brannsår i full tykkelse ble skapt symmetrisk på dorsum av hvite griser, som ble inokulert med (PA01) på dag 3 etter forbrenning; Deretter ble ikke-invasive vurderinger av sårhelingen utført på forskjellige tidspunkter ved bruk av laserspeckle imaging (LSI), høyoppløselig ultralyd (HUSD) og transepidermalt vanntap (TEWL). De inokulerte brannsårene ble dekket med en firelags bandasje. Biofilm, som etablert og bekreftet strukturelt av SEM på dag 7 etter inokulering, kompromitterte funksjonell sårlukking. Et slikt uheldig utfall er gjenstand for reversering som svar på passende tiltak.
Biofilminfeksjon kompliserer brannsår og kroniske sår og forårsaker kronisitet 1,2,3,4,5. I mikrobiologi studeres biofilmmekanismer primært, med fokus på mikrobene 1,6. Erfaringene fra disse studiene er av avgjørende betydning fra et biologisk vitenskapelig synspunkt, men kan ikke nødvendigvis gjelde for klinisk relevante patogene biofilmer 6,7,8. Klinisk relevante strukturelle biofilmaggregater bør inkludere mikrobielle så vel som vertsfaktorer 8,9,10. Et slikt mikromiljø muliggjør inkludering av vert-mikrobe iterative interaksjoner, som er avgjørende for å utvikle en klinisk relevant biofilm 7,8. I en slik prosess er deltakelsen av immunceller og blodbårne faktorer kritisk11,12. Vertsmikrobeinteraksjonene som ligger til grunn for kliniske patogene biofilmer, som sett i kroniske sår, forekommer over lang tid. Enhver eksperimentell tilnærming som tar sikte på å utvikle en translasjonelt relevant modell for biofilminfeksjon, må derfor ta hensyn til disse faktorene. Så vi søkte å utvikle en klinisk reproduserbar svinekronisk biofilminfeksjonsmodell.
Mens menneskelige studier klart representerer den beste tilnærmingen til å studere helbredende utfall, er de ofte ikke best egnet til å takle de underliggende mekanismene og nye mekanistiske paradigmer. Etiske hensyn begrenser bruken av studiedesign som krever innsamling av flere biopsier fra et kronisk sår på forskjellige tidspunkter. Det er derfor avgjørende å ha en veletablert og reproduserbar dyremodell for å muliggjøre invasive studier for grundig undersøkelse av biofilmskjebne 7,13. Valget av en dyremodell avhenger av flere faktorer, inkludert vitenskapelig/translasjonell relevans og logistikk. Svinesystemet er allment anerkjent for å være den mest translasjonelt verdifulle eksperimentelle modellen for å studere menneskelige hudsår7. Dermed rapporterer dette arbeidet en etablert svinemodell av biofilminfisert brannskade i full tykkelse. Dette arbeidet er basert på flere originale publikasjoner rapportert i litteraturen 2,7,13,14,15,16,17. I denne studien ble et klinisk isolat av multiresistente Pseudomonas aeruginosa (PA01) valgt for å infisere såret. P. aeruginosa er en vanlig årsak til sårinfeksjoner 2,18,19,20. Det er en gramnegativ bakterie som kan være vanskelig å behandle på grunn av dens motstand mot noen antibiotika11,19,21. Ingen av de rapporterte svinebiofilmmodellene så langt involverte 8 ukers langtidsstudier 22,23,24,25,26. Kroniske sår er de som forblir åpne i 4 uker eller mer 14,27,28. Det er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapportert i litteraturen. Dette arbeidet tar for seg begrepet funksjonell sårlukking 2,7,13,15,17,29.
Denne rapporten gir en detaljert protokoll for å sette opp en svinemodell av kronisk sårbiofilminfeksjon for eksperimentelle studier. Flere svinebiofilmmodeller har tidligere blitt rapportert 22,23,24,25,26, men ingen av dem er svinemodeller som involverer 8 ukers langtidsstudier. Kroniske sår er de som forblir åpne i 4 uker eller mer 14,27,28. Det er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapportert i litteraturen. Dette arbeidet tar for seg begrepet funksjonell sårlukking 2,7,13,15,17,29. En studie utført i 2014 var den første som rapporterte at biofilminfiserte sår kan lukke seg uten at barrierefunksjon7 gjenopprettes. Måling av hudbarrierefunksjonen i helbredelsessåret ved bruk av transepidermalt vanntap (TEWL) er rapportert i dette arbeidet.
Anatomisk og fysiologisk er svineskinnet, sammenlignet med huden til andre små dyr, en nærmere match med den menneskelige huden32,33,34. Både gris og menneskelig hud har en tykk epidermis 33, og det dermal-epidermale tykkelsesforholdet varierer fra 10: 1 til13: 1 hos gris, som kan sammenlignes med mennesker34,35. Histologisk og biomekanisk viser huden til mennesker og griser likheter i reteryggene, subdermalt fett, dermalt kollagen, hårfordeling, adnexale strukturer og blodkarstørrelse og distribusjon36,37,38. Funksjonelt deler både griser og mennesker likheter i sammensetningen av lipid-, protein- og keratinkomponentene i epidermale laget, samt sammenlignbare immunohistologiske mønstre37,38. Svinens immunsystem, sammenlignet med andre små dyr, deler høyere likheter med det menneskelige immunsystemet, noe som betyr at griser er en passende modell for studier på vertsinteraksjonene som er integrert i kompleksiteten til den patologiske biofilmen i sårinfeksjoner39. Den kritiske vurderingen av fordeler og ulemper ved ulike dyremodeller har ført til enighet om at griser representerer en effektiv modell for å studere sårheling34,38. I tillegg utvikler husdyr spontant kroniske bakterielle infeksjoner, som observert hos mennesker10. Brannskadeanordningen som brukes til å lage sårene er en avansert og automatisert brannskadeanordning som leverer varmeenergi basert på en temperatur avlest fra det målrettede hudstedet22,40. En slik tilnærming forbedrer strengheten og reproduserbarheten av brennskaden. Bruk av humane kliniske isolater av bakterier for å infisere grisesårene tilfører verdi som en preklinisk modell.
Brannskader er komplekse og forårsaker flere systemiske forstyrrelser20,41. Det er derfor viktig å gjenopplive grisen med tilstrekkelige væsker og forhindre hypotermi under anestesi og gjenoppretting. Flere faktorer kan forstyrre sårheling, inkludert ernæring etter brenning, væsker og smerte42. Tett oppfølging av ernærings- og smertevurderingene er derfor av betydning. Post-burn smerte kan være alvorlig og påvirke dyrets oppførsel og kosthold. Intervensjoner for å løse atferdsmessige bekymringer må aktivt vurderes. Regelmessig og kontinuerlig smerteskåring og ledelse er avgjørende. Et grundig smertevurderingsark med en svært detaljert smertebehandlingsplan er inkludert i denne protokollen. For å unngå krysskontaminering mellom sårene, bør det tas særlig hensyn til å påføre det første laget av bandasjen på hvert sår separat. Kritisk forsiktighet bør utvises ved håndtering av alle biofarlige materialer og når du utfører grundig desinfeksjon av utstyr, verktøy og hele operasjonsrommet. Påføringen av flere lag av bandasjen forhindrer grisen i å utsette sårene under arbeidet med å gni eller skrape kløen tilbake.
Grisen i den nåværende modellen ble ikke kompromittert av underliggende metabolske forstyrrelser (f.eks. diabetes), og derfor var effekten som ble studert rent virkningen av bakteriell biofilminfeksjon på sårheling. Modellen egner seg imidlertid til induksjon av diabetes (for eksempel ved bruk av streptozotocin) og kan brukes til å studere biofilminfeksjon i forhold til en underliggende metabolsk lidelse. Den andre begrensningen i modellen er den kontrollerte infeksjonsinnstillingen ved hjelp av P. aeruginosa, en bakterie. Det forventes at grisens normale hudmikroflora også kan vokse i såret og kan påvirke tilhelingen. Videre analyse ved hjelp av NGS eller andre avanserte teknikker for å avgrense det mikrobielle innholdet i såret er nødvendig. Den nåværende modellen kan også brukes på blandede infeksjoner med forskjellige mikrobielle arter (f.eks. Sopp, viral, etc.). Dette er et viktig element, da klinisk relevante sår sannsynligvis vil være befolket av blandede mikrober, noe som kan påvirke sårheling forskjellig.
Det er mange potensielle fordeler i denne modellen, inkludert likheten med kompleksiteten og langsiktige følgetilstander av humane kroniske sår, den automatiserte og reproduserbare brenneprosessen og bruken av klinisk isolerte bakteriearter. Bruken av flere ikke-invasive bildebehandlingsmodaliteter representerer en kraftig tilnærming for å samle nyttige fysiologiske data som karakteriserer såret. Til slutt er vurderingen av funksjonell sårheling via restaurering av hudbarrierefunksjon basert på TEWL kritisk. Avslutningsvis er en robust, enkel, detaljert og brukervennlig protokoll for å utvikle en biofilminfisert alvorlig brannskade ved hjelp av et svinemodellsystem vist i dette arbeidet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, for deres støtte og veterinærpleie av dyrene under studien. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health tilskudd NR015676, NR013898 og DK125835 og forsvarsdepartementets tilskudd W81XWH-11-2-0142. I tillegg dro dette arbeidet nytte av følgende National Institutes of Health-priser: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 og NS42617.
Sedation | |||
Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
Anesthetic | |||
Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
Surgery | |||
Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
Paper tape | McKesson | 455531 | |
2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
Analgesia | |||
Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
Fentanyl Transdermal | |||
Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
Bandaging | |||
Transparent film dressing 26×30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
Imaging | |||
Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
Biopsy/Tissue Collection | |||
6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
OCT Cassette | |||
Non Woven Gauze 4×4 | Pivetal | 21295051 | |
Inoculum | |||
Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
Euthanasia | |||
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |