Her præsenterer vi en protokol til analyse af ændringer i mitokondrietæthed og langsgående fordeling ved billeddannelse af levende skeletmuskler ved hjælp af konfokalmikroskopi til mitokondrienetværksscanning.
Mitokondriet er en organel, der kan forlænges, fragmenteres og renoveres i henhold til cellernes metaboliske krav. Ombygningen af mitokondrienetværket gør det muligt for sunde mitokondrier at imødekomme cellulære krav; Tabet af denne kapacitet har imidlertid været relateret til udviklingen eller progressionen af forskellige patologier. I skeletmuskulatur observeres mitokondrietæthed og distributionsændringer i fysiologiske og patologiske tilstande som motion, aldring og fedme, blandt andre. Derfor kan undersøgelsen af mitokondrienetværket give en bedre forståelse af mekanismer relateret til disse forhold.
Her beskrives en protokol for mitokondriebilleddannelse af levende skeletmuskelfibre fra rotter. Fibre dissekeres manuelt i en afslappende opløsning og inkuberes med en fluorescerende levende cellebilleddannelsesindikator for mitokondrier (tetramethylrhodamin ethylester, TMRE). Mitokondriesignalet registreres ved konfokalmikroskopi ved hjælp af XYZ-scanningstilstanden for at opnå konfokale billeder af det intermyofibrillære mitokondrie (IMF) netværk. Derefter behandles de konfokale billeder ved tærskel og binarisering. Det binariserede konfokale billede tegner sig for de positive pixels for mitokondrier, som derefter tælles for at opnå mitokondrietætheden. Mitokondrienetværket i skeletmuskulatur er kendetegnet ved en høj tæthed af IMF-population, som har en periodisk langsgående fordeling svarende til T-tubuli (TT). Fast Fourier Transform (FFT) er en standardanalyseteknik, der udføres for at evaluere fordelingen af TT, der gør det muligt at finde distributionsfrekvensen og niveauet for deres organisation. I denne protokol beskrives implementeringen af FFT-algoritmen til analyse af den langsgående mitokondriefordeling i skeletmuskulatur.
Mitokondrier danner meget dynamiske netværk, der hovedsageligt reguleres af balancen mellem dens forlængelse (fusion) og fragmentering (fission)1,2, som moduleres af ekspression og aktivitet af proteiner som Mitofusin 1 og 2 (Mfn1 og Mfn2) og optisk proteinatrofi 1 (Opa1), som regulerer fusionen af den ydre mitokondriemembran og indre membran, henholdsvis 1,2. Dynaminrelateret protein (Drp1) regulerer overvejende mitokondriefission, når det fosforyleres i Ser6163.
I skeletmuskulaturen er det veletableret, at mitokondrienetværket er arrangeret i strukturelt veldefinerede subpopulationer baseret på deres nærhed til forskellige celleregioner (myofibriller, sarcolemma og kerner)4,5. Disse mitokondrier placeret lige under sarcolemma kaldes subsarcolemmal mitokondrier (SSM), dem placeret mellem kontraktile filamenter kaldes intermyofibrillære mitokondrier (IMF), og mitokondrie-subpopulationen omkring kernerne kaldes perinukleære mitokondrienetværk (PMN). Desuden er det blevet foreslået, at disse mitokondrie subpopulationer har regionsspecifikke funktioner og er metabolisk specialiserede 4,5.
Vedligeholdelsen af cellulær energihomeostase, som tillader metabolisk og kontraktil funktion, afhænger i vid udstrækning af interaktionen og kommunikationen på specifikke steder gennem mitokondrienetværket (f.eks. IMF og SSM-interaktion)4,6. Ud over mitokondrier netværksinteraktioner kan mitokondriet også interagere med andre organeller, der danner strukturelle og funktionelle komplekser. I denne henseende har det vist sig, at IMF kan placeres ved siden af det sarkoplasmatiske retikulum (SR) og i nærheden af Ca2+ frigivelsesenhederne (CRU), dannet af de tværgående rør (TT)7. Denne kendsgerning er relevant på grund af mitokondriel Ca2+ optagelse i reguleringen af ATP-syntese og apoptose. For nylig er en potentiel rolle i reguleringen af cytosoliske Ca2+ transienter også blevet foreslået8.
TT er invaginationer af sarcolemma, der har en periodisk fordeling langs længdeaksen af kardiomyocytter og skeletmuskelfibre 9,10, svarende til IMF-fordelingen 5. Ændringer i fordelingen af TT har vigtige fysiologiske implikationer på grund af deres rolle i kontraktil funktion. Disse ændringer er imidlertid hovedsageligt blevet evalueret i kardiomyocytter. Brug af Fast Fourier Transform (FFT) analyse tillader konvertering af periodiske signaler fra afstandsdomænet til frekvensdomænet, hvilket resulterer i et FFT-spektrum, der angiver frekvensen og regelmæssigheden af signalet11,12,13. Selvom der er tegn på, at organiseringen af mitokondrienetværket i skeletmuskelfibre er afgørende for tilpasning til forskellige metaboliske forhold, som under regenerering efter muskelskade14,15, udføres de fleste analyser kvalitativt.
Da mitokondriel dysfunktion desuden har været forbundet med flere skeletmuskelrelaterede (f.eks. atrofi uden brug)2 og ikke-muskelsygdomme, især stofskiftesygdomme, og det dermed forbundne tab af muskelmasse (dvs. atrofi)16, er den kvantitative evaluering af mitokondrienetværket og fordelingen i skeletmuskulaturen relevant. For nylig er en signifikant forskel i den langsgående fordeling af mitokondrier af gastrocnemius muskelfibre mellem en overvægtig gruppe (Ob; Zucker fa/fa rotter), og en mager gruppe (Lean; Zucker +/+ rotter) blev identificeret gennem FFT17. Denne undersøgelse viste nytten af FFT til analyse af mitokondriefordelingen. Derfor præsenterer denne protokol en metode til undersøgelse af mitokondrier i levende skeletmuskelfibre fra billeder opnået ved fluorescenskonfokal mikroskopi. Mitokondrietæthed kvantificeres ved baggrundstærskel, og analysen af langsgående mitokondriefordeling ved FFT-analyse beskrives også. Et workflow-skema er vist i figur 1.
Mitokondrier er organeller med høj ombygningskapacitet. Deres indhold, densitet og fordeling kan hurtigt ændres gennem aktivering af mitokondriefusions- og fissionsmekanismerne, kendt som mitokondriedynamik1, og balancen mellem mitokondrieomsætningsmekanismerne: mitokondriebiogenesen og den specialiserede mitokondrienedbrydningsvej, mitofagien21,22. Mitokondrieindhold og morfologi kan variere alt efter celletype og udviklingsstadium og kan ombygges under forskellige fysiologiske og patologiske stimuli 17,22,23,24. Derfor har undersøgelsen af mitokondriel morfologi været relevant i over et halvt århundrede25. Især har analysen af mitokondrier gennem elektronmikroskopi været standardteknikken anvendt i flere undersøgelser26.
Fluorescerende undersøgelser ved konfokalmikroskopi har fået relevans i de sidste par år på grund af deres kapacitet til levende cellebilleddannelse af mitokondrier ved forskellige fiberdybder, hvilket kan hjælpe med bedre at forstå mitokondriernes rolle i skeletmuskulatur under forskellige adaptive og maladaptive forhold27. I denne undersøgelse beskrives en metode til analyse af mitokondriers tæthed og fordeling i levende skeletmuskelfibre ved konfokal mikroskopi. En af de største udfordringer ved at arbejde med levende skeletmuskelfibre er at undgå sammentrækning fra isolationsprocesserne op til mitokondriekonfokal optagelse. For at nå dette mål bruges en høj Mg- og ATP Relax-opløsning17 til at holde fibrene afslappede i mindst 2 timer, hvilket giver tilstrækkelig tid til at udføre fiberisoleringsprocessen, fluoroforbelastningen og erhvervelsen af mitokondriesignal ved konfokal mikroskopi. Et kritisk punkt i protokollen er at opnå fibrene mekanisk, da det kræver høj præcision og frisk væv; Det er dog muligt at opnå levedygtige fiberbundter fra rottemuskler med denne tidligere anvendte og rapporterede teknik28. Opnåelse af intakte fibre gør det muligt at bevare sarcolemma og det intracellulære miljø og holde den metaboliske og funktionelle krydstale mellem cellestrukturer28,29.
I modsætning til at arbejde med væv eller faste celler muliggør erhvervelsen af levende cellebilleddannelse fluorescerende billeder ved konfokal mikroskopi realtidsovervågning af effekten af forskellige eksperimentelle tilstande. Denne protokol kan bruges til at udforske ændringer i mitokondrietæthed og fordeling i realtid og udforske forskelle mellem eksperimentelle grupper, såsom eksemplerne præsenteret her mellem Lean og Ob-afledte fibre (figur 3 og figur 4). Det bør altid overvejes, at levende cellebilleddannelse indebærer standardisering af optimale arbejdsforhold med mindre celleskader. Arbejdstiden, kvaliteten af de anvendte opløsninger, anskaffelsesparametrene og eksponeringen af lasere skal kontrolleres fint. Derfor er væsentlige overvejelser nævnt nedenfor.
Mitokondrier af muskelfibre kan ikke registreres helt i længderetningen ved konfokal mikroskopi på grund af fiberens størrelse og beskadigelsen af fiberen, der kan være forårsaget af lang lasereksponering. Ikke desto mindre registreres en repræsentativ prøve af fiberen under denne teknik. Selvom det er muligt at registrere hele tykkelsen af skeletmuskelfiberen hos en rotte ved konfokal mikroskopi, indebærer dette en længere registreringstid og eksponering for laserstrålen. I tilfælde af kontrolrotter er der ikke stødt på problemer med disse optagelser. Imidlertid kan fibre fra patologiske tilstande være mere modtagelige for skader som observeret i fibrene fra Ob-rotter. Derfor foretrækkes erhvervelse af en stak repræsentative konfokale billeder opnået ved forskellige Z-afstande. Når kun et afsnit af fibertykkelse registreres, anbefales det at tage stakken i samme dybde på alle testede fibre, da mitokondriefordeling og densitet kan variere alt efter dens position i fiberen. Det anbefales at opfange signalet i en dybde over 15 μm for at opnå repræsentative konfokale billeder af IMF, så man undgår SSM-populationer, der ligger tæt på periferien.
Under den konfokale erhvervelse skal der tages hensyn til nogle vigtige overvejelser. Først valget af nedsænkningsobjektivobjektivet under hensyntagen til forstørrelsen, høj NA og nedsænkningsmedium. Da celler opretholdes i et hydrofilt inkubationsmedium, skal brydningsindekset for inkubations- og nedsænkningsmediet være ens for at opnå et godt signal og scanne dybt ind i vævet. Normalt opnås ved hjælp af en objektivlinse til nedsænkning i vand. Konfokale billeder af figur 3 og figur 4 blev erhvervet med et 20x, 0,7 NA, vandnedsænkningsmål. Dette mål tillader registrering af fiberen i al dens dybde, men scanning ved 15, 18 og 21 μm blev besluttet, da repræsentative konfokale billeder af IMF kan opnås med signal med høj fluorescensintensitet og mindre fiberskader. Anden forstørrelse, såsom 40x og olie som nedsænkningsmedium, kan overvejes, men skal evalueres.
For det andet beregnes pixelstørrelsen til billedoptagelse i henhold til Nyquist-sætningen, som gør det muligt at vælge en passende pixelstørrelse, der undgår oversample (højere lasereksponering) og undersample (fører til mindre opløsning)30. Beregningen afhænger af egenskaberne for den valgte objektivlinse og bølgelængden (~ 90 nm). Det kan justeres med zoom; Derfor giver kun én zoomindstilling en optimal pixelstørrelse30. Ikke desto mindre afhænger zoomen i praksis også af det område af prøven, der skal analyseres. At finde balance gør det således muligt at arbejde med en pixelstørrelse, der er tættest på Nyquist-kriteriet, og som også passer til det område, der skal analyseres. Figur 3 og figur 4 blev erhvervet med en pixelstørrelse på 150 og 190 nm, hvilket muliggjorde analyse af fiberens fulde bredde, som er ~ 50-80 μm.
For det tredje skal der anvendes en passende pinholediameter, der forhindrer lys ude af fokus i at nå detektoren. Typisk betragtes 1 Airy som den optimale pinhole-størrelse, da den tillader detektion af ~ 80% af fotoner, der stammer fra fokusplanet30. Ikke desto mindre kræver nogle farvede biologiske prøver, der viser lave fluorescensniveauer, en pinhole stigning30. Konfokale billeder af figur 3 og figur 4 blev erhvervet med en pinhole størrelse på 3 Airy på grund af et lavt signal fanget med en lavere Airy. Det er vigtigt at overveje, at stigningen i signalintensiteten som følge af at øge pinhole-størrelsen fører til reduktion af opløsningen på grund af øget ude af fokus fanget lys. Af denne grund anbefalede vi at bruge en pinhole størrelse så tæt på 1 luftig som muligt.
Når de er tilstrækkeligt erhvervet, kan konfokale billeder behandles for at opnå kvantitativ information om mitokondrietæthed og fordeling. Uanset hvad skal det kritiske behandlingsbilledtrin med tærskelværdi udføres før analyse for at forbedre kvantificeringen af signalet. Under dette afgørende trin defineres fluorescensintensitetsværdien, der adskiller de positive pixels for mitokondrier fra baggrundens. Tærsklen kan defineres ved en Gaussisk pasform af toppen, der repræsenterer mitokondrier, når billedets histogram viser to toppe, den ene svarende til baggrunden og den anden til mitokondrierne. Der opnås imidlertid ikke altid en bimodal fordeling i hvert af billederne, så andre tærskelværdier skal anvendes.
I denne protokol beskrives implementeringen af Otsu’s tærskelværdi, som er en ikke-parametrisk og uovervåget metode designet til at finde tærskelværdien, når de to toppe ikke er adskilt, eller andre toppe er til stede31. Otsu kan let anvendes ved hjælp af en open source-platform til biologisk billedanalyse; Andre tærskelværdier kan dog testes. Den samme tærskelmetode skal anvendes på alle konfokale billeder og skal beregnes uafhængigt for hvert konfokalbillede. Anvendelse af tærsklen på en hel stak fører til forkerte resultater. Når de binære billeder er opnået efter tærskelprocessen, kan analysen af mitokondrietæthed og FFT let udføres ved at følge instruktionerne beskrevet i denne protokol. Ved udførelse af begge analyser bør man dog være omhyggelig med at undgå at medtage kerner og kapillærer, da det ville føre til kvantificeringsfejl. Med hensyn til tæthed er det nok at trække pixels eller det område, der er optaget af kernerne eller kapillærerne, fra pixels eller det samlede areal, der skal analyseres. Derudover skal det ved udførelse af FFT-analysen verificeres, at mitokondriesignalet er lige. Omvendt, når mitokondriesignalet vippes, kan det producere profiler, der ikke repræsenterer mitokondriefordelingen i længderetningen, hvilket giver forkerte FFT-spektrumdata. Derudover kan der anvendes et forbehandlingstrin for at reducere støj i billederne. Denne protokol beskriver to valgfrie forbehandlingstrin ved hjælp af et medianfilter og 2D-dekonvolution. Virkningerne af disse forbehandlingsmetoder på billed- og mitokondrietæthedsindholdet er vist i supplerende figur S1. Det er vigtigt at overveje, at selvom disse forprocesser kan forbedre billedkvaliteten, kan de også resultere i tab af visse billeddetaljer. Derfor bør de bruges med forsigtighed og konsekvent anvendes på alle de billeder, der analyseres.
På trods af dets fordele er konfokalmikroskopi begrænset af en lateral opløsning (XY) på 180-250 nm, når de optimale betingelser for erhvervelse implementeres32. Mitokondriediameter er ~ 200-700 nm, tæt på diffraktionsgrænsen for konfokal mikroskopi; Submitokondriestrukturer kan således ikke påvises tilstrækkeligt33 og kan ikke evalueres ved densitets- og FFT-analyser vist i denne protokol. Andre superopløsningsteknikker til mikroskopi, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimuleret emissionsudtømning (STED) nanoskopi eller struktureret belysningsmikroskopi (SIM), kan undersøges for at løse submitokondriestrukturer32. I denne protokol opnås de konfokale billeder af mitokondrier under anvendelse af fluoroforen TMRE, som afhænger af mitokondriemembranpotentialet. Derfor kan mitokondriel fluorescerende intensitet variere alt efter deres membranpotentiale. En tærskelproces udføres før dataanalysen for at løse dette problem. Alle pixels over en defineret tærskel betragtes som positive for mitokondriesignal uafhængigt af deres fluorescensværdi. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at mitokondrier med et meget lavt membranpotentiale ikke kan løses med denne teknik. Det anbefales derfor at gennemføre komplementære undersøgelser af kvantificering af mitokondrieproteinindholdet. En fordel ved at bruge TMRE er, at konfokale billeder også kan bruges til mitokondriemembranpotentialeanalyse, men der skal udføres tilstrækkelig kontrol med afkoblingsmidler, såsom carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP). Derudover kan instruktionerne til mitokondriel densitet og distributionsanalyse opnås ved hjælp af grønne fluorescerende indikatorer for mitokondrier, som belaster mitokondrier uanset deres membranpotentiale, men inkubationsstrategi og konfokale erhvervelsesindstillinger skal standardiseres.
I betragtning af at mitokondriestruktur er relateret til væsentlige mitokondrie og cellulære funktioner, kan protokollen beskrevet her give værdifuld information om deres ombygning under sygdom eller ved en bestemt stressfornærmelse. Det kan bidrage til en bedre forståelse af nøglefunktioner i skeletmuskulatur, der styres af mitokondrier, såsom energiproduktion, eller hvor mitokondrier spiller en vigtig rolle i samspillet med andre organeller, såsom sammentrækning-metabolisme-kobling. At følge protokolinstruktionerne tillader estimering af mitokondriel tæthed og fordeling i levende skeletmuskulatur. Protokoltrinnene er opdelt i tre hovedfaser med fokus på dissektion af skeletmuskelbundter, konfokal mikroskopiscanning og billedanalyse, hvor detaljerede instruktioner og vigtige overvejelser er inkluderet. Især kan protokollen optimeres yderligere for at udforske yderligere Z-trin til fuld mitokondriel rekonstruktion i fiberen i henhold til brugerens fornødenheder. For eksempel kan de konfokale billed- og analysetrin testes for at studere cellulære strukturer med lignende fordeling, såsom TT i levende og faste prøver.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af School of Medicine og Institute for Obesity Research of Tecnologico de Monterrey. Figur 3A blev oprettet med Scientific Image og Illustration software.
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Forceps | Miltex | MH-18 | |
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |