Fluorométrie fonctionnelle dirigée dans des cellules natives pour étudier l’excitabilité des muscles squelettiques

Summary

La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site est une méthode permettant d’étudier les mouvements du domaine protéique en temps réel. La modification de cette technique pour son application dans les cellules natives permet maintenant la détection et le suivi des mouvements du capteur de tension unique à partir de canaux Ca²⁺ voltage-dépendants dans des fibres musculaires squelettiques isolées murines.

Abstract

La fluorométrie fonctionnelle dirigée vers le site a été la technique de choix pour étudier la relation structure-fonction de nombreuses protéines membranaires, y compris les canaux ioniques voltage-dépendants. Cette approche a été utilisée principalement dans les systèmes d’expression hétérologues pour mesurer simultanément les courants membranaires, la manifestation électrique de l’activité des canaux et les mesures de fluorescence, rapportant des réarrangements de domaine local. La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site combine l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la chimie et la fluorescence en une seule technique de grande envergure qui permet d’étudier les réarrangements structurels en temps réel et la fonction par fluorescence et électrophysiologie, respectivement. En règle générale, cette approche nécessite un canal membranaire voltage-dépendant qui contient une cystéine qui peut être testée par un colorant fluorescent thiol-réactif. Jusqu’à récemment, la chimie réactive aux thiols utilisée pour le marquage fluorescent dirigé des protéines était réalisée exclusivement dans les ovocytes et les lignées cellulaires Xenopus , limitant la portée de l’approche aux cellules primaires non excitables. Ce rapport décrit l’applicabilité de la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur le site dans les cellules musculaires squelettiques adultes pour étudier les premières étapes du couplage excitation-contraction, le processus par lequel la dépolarisation électrique des fibres musculaires est liée à l’activation de la contraction musculaire. Le présent protocole décrit les méthodologies de conception et de transfection des canaux Ca²⁺ voltage-dépendants modifiés par cystéine (Ca_V1.1) dans les fibres musculaires du fléchisseur digitorum brevis de souris adultes en utilisant l’électroporation in vivo et les étapes ultérieures requises pour les mesures fluorométriques fonctionnelles dirigées vers le site. Cette approche peut être adaptée pour étudier d’autres canaux ioniques et protéines. L’utilisation de la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur le site du muscle des mammifères est particulièrement pertinente pour étudier les mécanismes de base de l’excitabilité.

Introduction

La capacité de suivre les réarrangements conformationnels des canaux ioniques en réponse à un stimulus électrique connu dans une cellule vivante est une source d’informations précieuses pour la physiologie moléculaire¹. Les canaux ioniques voltage-dépendants sont des protéines membranaires qui détectent les changements de tension transmembranaire, et leur fonction est également affectée par les changements de tension². Le développement des techniques de pince de tension au siècle dernier a permis aux physiologistes d’étudier, en temps réel, les courants ioniques transportés par les canaux ioniques voltage-dépendants en réponse à la dépolarisation membranaire³. L’utilisation de la technologie de pince de tension a été cruciale pour comprendre les propriétés électriques des cellules excitables telles que les neurones et les muscles. Dans les années 1970, le raffinement de la pince de tension a permis la détection des courants de déclenchement (ou mouvement de charge) dans les canaux ^4,5 dépendants de la tension^du calcium (Ca V) et du sodium (Na_V). Les courants de déclenchement sont des courants capacitifs non linéaires qui résultent du mouvement des capteurs de tension en réponse aux changements du champ électrique à travers la membrane cellulaire⁶. Les courants de déclenchement sont considérés comme une manifestation électrique des réarrangements moléculaires qui précèdent ou accompagnent l’ouverture du canal ionique⁷. Bien que ces mesures de courant fournissent des informations précieuses sur la fonction du canal, les courants ioniques et les courants de déclenchement sont des lectures indirectes des réarrangements conformationnels inter- et intramoléculaires des canaux voltage-dépendants⁷.

La fluorométrie fonctionnelle dirigée sur site (FSDF; également appelée fluorométrie à pince de tension, VCF) a été développée au début des années 1990⁸ et, pour la première fois, a permis de visualiser directement les changements conformationnels locaux et la fonction d’une protéine de canal en temps réel. En utilisant une combinaison de mutagénèse des canaux, d’électrophysiologie et de systèmes d’expression hétérologues, il est possible de marquer et de suivre par fluorescence les parties mobiles de canaux ou de récepteurs spécifiques en réponse au stimulus activateur ^9,10. Cette approche a été largement utilisée pour étudier les mécanismes de détection de tension dans les canaux ioniques voltage-dépendants 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Pour les examens faisant autorité, voir 10,20,21,22,23.

Les canaux Ca V et Na_V, critiques pour l’initiation et la propagation des signaux électriques, sont composés d’une sous-unité principale α1, qui possède un pore central et quatre domaines de détection de tension^{non identiques2}. En plus de leur structure primaire distincte, les canaux Ca V et Na_V sont exprimés en complexes multi-sous-unités avec des sous-unités auxiliaires²⁴. Les canaux potassiques voltage-dépendants (K V) sont constitués de quatre sous-unités qui ressemblent à un seul domaine de Na V ou Ca_V²⁵. La sous-unité α1 formant des pores et détectant la tension des canaux Ca V et Na_V est formée par un seul polypeptide codant pour quatre domaines individuels de six segments transmembranaires uniques (S1-S6; Figure 1A) ^24,26. La région comprise par les segments transmembranaires S1 à S4 forme le domaine de détection de tension (VSD) et les segments transmembranaires S5 et S6 forment le domaine poreux²⁶. Dans chaque VSD, la α-hélice S4 contient de l’arginine ou de la lysine chargée positivement (Figure 1A,B) qui se déplacent en réponse à la dépolarisation de la membrane⁷. Plusieurs décennies de recherche et les résultats d’approches expérimentales très diverses soutiennent la prémisse selon laquelle les segments S4 se déplacent vers l’extérieur, générant des courants de gating, en réponse à la dépolarisation de la membrane⁶.

FSDF mesure les changements de fluorescence d’un colorant thiol-réactif conjugué à un résidu spécifique de cystéine (c.-à-d. l’hélice α-hélice S4) sur un canal ionique ou une autre protéine, conçu par mutagénèse dirigée, lorsque le canal fonctionne en réponse à la dépolarisation de la membrane ou à d’autres stimuli¹⁰. En fait, FSDF a été développé à l’origine pour étudier si le segment S4 dans les canaux K_V, proposé pour être le capteur de tension principal du canal, se déplace lorsque les charges de déclenchement se déplacent en réponse aux changements de potentiel de membrane ^8,10. Dans le cas de canaux ioniques voltage-dépendants, FSDF peut résoudre des réarrangements conformationnels indépendants des quatre VSD (suivi d’un VSD à un moment donné), en même temps que les mesures de la fonction du canal. En effet, en utilisant cette approche, il a été démontré que les VSD individuels semblent être impliqués différemment dans des aspects spécifiques de l’activation et de l’inactivation des canaux 12,27,28,29,30. L’identification de la contribution de chaque VSD à la fonction des canaux est d’une grande pertinence et peut être utilisée pour élucider davantage le fonctionnement des canaux et potentiellement identifier de nouvelles cibles pour le développement de médicaments.

L’utilisation de la FSDF dans les systèmes d’expression hétérologues a été extrêmement utile pour approfondir notre compréhension de la fonction des canaux dans une perspective réductionniste^10,23. Comme beaucoup d’approches réductionnistes, elle présente des avantages mais a aussi des limites. Par exemple, une limitation majeure est la reconstitution partielle du nanoenvironnement du canal dans le système hétérologue. Souvent, les canaux ioniques interagissent avec de nombreuses sous-unités accessoires et de nombreuses autres protéines qui modifient leur fonction³¹. En principe, différents canaux et leurs sous-unités accessoires peuvent être exprimés dans des systèmes hétérologues avec l’utilisation de constructions codantes protéiques multiples ou de plasmides polycistroniques, mais leur environnement natif ne peut pas être entièrement reconstitué^30,32.

Notre groupe a récemment publié une variante de FSDF dans des fibres musculaires squelettiques dissociées natives pour l’étude des étapes précoces du couplage excitation-contraction (ECC)^33,34, le processus par lequel la dépolarisation électrique des fibres musculaires est liée à l’activation de la contraction musculaire^35,36. Pour la première fois, cette approche a permis le suivi de mouvement de capteurs de tension S4 individuels à partir du canal Ca²⁺ de type L voltage-dépendant (Ca_V1.1, également connu sous le nom de DHPR) dans l’environnement natif d’une fibre musculaire différenciée^{adulte 37}. Cela a été accompli en considérant de multiples caractéristiques de ce type de cellule, y compris l’activité électrique de la cellule permettant une dépolarisation auto-propagée induite par stimulation rapide, la capacité d’exprimer le plasmide de l’ADNc par électroporation in vivo, la haute expression naturelle et l’organisation compartimentale des canaux dans la cellule, et sa compatibilité avec les dispositifs d’imagerie et d’enregistrement électrophysiologique à grande vitesse. Auparavant, nous utilisions un microscope confocal à balayage linéaire à grande vitesse comme dispositif^{de détection 37}. Maintenant, une variante de la technique est présentée à l’aide d’une photodiode pour l’acquisition du signal. Ce système de détection à base de photodiodes pourrait faciliter la mise en œuvre de cette technique dans d’autres laboratoires.

Ici, un protocole étape par étape pour utiliser FSDF dans les cellules natives pour l’étude du mouvement individuel du capteur de tension à partir de Ca_V1.1 est décrit. Bien que le canal Ca_V1.1 ait été utilisé comme exemple tout au long de ce manuscrit, cette technique pourrait être appliquée à des domaines extracellulaires accessibles d’autres canaux ioniques, récepteurs ou protéines de surface.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Maryland. Le protocole suivant a été divisé en plusieurs sous-sections, comprenant (1) la conception de la construction moléculaire et la sélection du colorant réagissant à la cystéine, (2) l’électroporation in vivo , (3) la dissection musculaire et l’isolement des fibres, (4) la description de la configuration de l’acquisition, (5) l’évaluation de l’activité électrique …

Representative Results

Lorsque des potentiels d’action de propagation sont déclenchés en réponse à une stimulation de champ répétitive, il est possible de suivre le mouvement spécifique du capteur de tension en réponse à une fréquence spécifique de dépolarisation. Comme le montre la figure 6A, le mouvement des hélices marquées VSD-II peut être suivi en réponse à chacune des deux dépolarisations successives appliquées à 10 Hz (c.-à-d. espacées de 100 ms). Le blanchiment du signal peut être …

Discussion

Ici, un protocole étape par étape pour effectuer FSDF dans les fibres musculaires pour l’étude des mouvements individuels du capteur de tension du canal Ca_V1.1 est décrit. Même si le nombre d’étapes et la diversité des approches combinées dans cette technique peuvent sembler complexes, la plupart de ces techniques sont souvent couramment utilisées dans les laboratoires de biophysiciens et de biologistes cellulaires. Ainsi, la complexité apparente réside principalement dans la combinaison de tout…

Materials

Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA