Evaluación del efecto afidicida de hongos entomopatógenos contra insectos partenogenéticos, pulgón de la mostaza, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Este protocolo presenta un sistema optimizado de bioensayo de hojas sueltas para evaluar la efectividad de hongos entomopatógenos (EPF) contra el pulgón de la mostaza (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecto partenogenético. El método describe el proceso de recopilación de datos durante los experimentos con placas de Petri, lo que permite a los investigadores medir de manera consistente la virulencia de EPF contra pulgones de la mostaza y otros insectos partenogenéticos.
Abstract
El pulgón de la mostaza (L. erysimi) es una plaga que infesta varios cultivos crucíferos y transmite virus de plantas. Para lograr un manejo ecológico de plagas, los hongos entomopatógenos (EPF) son agentes potenciales de control microbiano para controlar esta plaga. Por lo tanto, es necesario realizar un cribado de virulencia de los aislados de EPF en condiciones de placa de Petri antes de la aplicación en campo. Sin embargo, el pulgón de la mostaza es un insecto partenogenético, lo que dificulta el registro de datos durante los experimentos con placas de Petri. Para abordar este problema, se desarrolló un sistema modificado para bioensayos de hojas separadas, utilizando un micropulverizador para inocular conidios en pulgones y evitar ahogamientos al facilitar el secado al aire después de la suspensión de esporas. El sistema mantuvo una alta humedad relativa durante todo el período de observación, y el disco foliar permaneció fresco durante más de diez días, lo que permitió la reproducción partenogenética de los pulgones. Para evitar la acumulación de crías, se implementó un proceso de eliminación diaria con un pincel para pintar. Este protocolo demuestra un sistema estable para evaluar la virulencia de los aislados de EPF contra pulgones de la mostaza u otros pulgones, lo que permite la selección de aislados potenciales para el control de pulgones.
Introduction
El pulgón de la mostaza (L. erysimi) es una plaga notoria que infesta una variedad de cultivos crucíferos, causando importantes pérdidas económicas1. Si bien se han recomendado varios insecticidas sistemáticos para combatir las infestaciones de pulgones, el uso frecuente de estos insecticidas plantea preocupaciones sobre la resistencia a los plaguicidas 2,3. Por lo tanto, en términos de manejo ecológico de plagas, los hongos entomopatógenos (EPF) podrían servir como una estrategia de control alternativa adecuada. El EPF es un patógeno de insectos con la capacidad de infectar a los huéspedes al penetrar en sus cutículas, lo que lo convierte en un potente agente para controlar pulgones y otros insectos chupadores de plantas4. Además, la EPF ha demostrado ser una técnica de manejo de plagas factible y sostenible, que ofrece beneficios como el antagonismo entre patógenos de plantas y la promoción del crecimiento de las plantas5.
El EPF puede obtenerse mediante cebos de suelo de insectos o aislado de cadáveres de insectos en el campo 6,7. Sin embargo, antes de seguir utilizando aislados de hongos, es necesario realizar un cribado de la patogenicidad. Se han realizado varios estudios sobre la eficacia de la EPF contra los pulgones, que son plagas importantes de los cultivos que pueden causar daños graves 8,9. Los pulgones de la mostaza, entre varias especies de pulgones, han sido probados para determinar su susceptibilidad a varias cepas de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., e incluso Alternaria, que se conoce principalmente como un hongo saprófito y fitopatógeno, pero ha mostrado algunos efectos letales contra los pulgones de la mostaza10,11,12.
Para evaluar la eficacia de la EPF contra los pulgones en condiciones de laboratorio, los bioensayos pueden dividirse en dos partes principales: la cámara de inoculación y la inoculación fúngica. El protocolo actual describe la construcción de una cámara de inoculación, donde los pulgones pueden mantenerse utilizando varios métodos, como una hoja extirpada con un pecíolo envuelto en algodón húmedo, un disco de hoja extirpado con una placa de Petri forrada con papel de filtro humedecido, el mantenimiento directo en plantas en maceta o un disco de hoja extirpado incrustado en agar agua dentro de una placa de Petri o recipiente10. 11,13. Los métodos comunes para la inoculación de hongos incluyen la fumigación de conidios, la inmersión de pulgones en una suspensión de conidios, la inmersión de hojas en una suspensión de conidios y la inoculación de endófitos de plantas11,14,15,16. Si bien existen varios métodos de inoculación, los bioensayos deben simular las condiciones de aplicación en el campo. Por ejemplo, en el caso del método de inmersión foliar12,17, se puede evaluar la eficiencia de la EPF, pero dado que los pulgones infestan las hojas cargadas de hongos, el lado dorsal del pulgón, que es un sitio de penetración preferencial, generalmente no se expone al hongo.
Para evaluar el efecto afidicida de la FEP en condiciones de laboratorio, este protocolo sugiere utilizar el método de hojas separadas descrito por Yokomi y Gottwald18 con algunas modificaciones, seguido de la inoculación de conidios con un microaspersor. Este método mantiene aproximadamente el 100% de humedad en la cámara de bioensayo durante al menos siete días sin requerir reposición adicional de agua18,19. Además, confinar a los pulgones a una superficie asegura su exposición a la fumigación de conidios y facilita las observaciones20. Sin embargo, los pulgones pueden atascarse en la superficie expuesta del agar mientras se mueven dentro de la cámara de inoculación. Además, el registro de datos en el experimento de la placa de Petri con pulgones de la mostaza, que son insectos partenogenéticos, puede ser un desafío debido a su rápido desarrollo y reproducción. Es difícil distinguir entre los adultos inoculados y su progenie sin extirpación. Los detalles de cómo proceder con este paso rara vez se mencionan, y algunos factores inconsistentes, como el área de consumo de hojas, deben optimizarse.
Este protocolo demuestra un sistema estable para el cribado de la virulencia de los aislados de EPF frente a los pulgones de la mostaza, lo que permite la selección de posibles aislados frente a varias especies de pulgones de una extensa biblioteca de EPF. Se pueden identificar pulgones recolectados en el campo y se puede establecer una población de laboratorio suficiente de pulgones de la mostaza para evaluar el efecto afidicida de varios aislados de hongos utilizando una metodología fácil y factible con resultados consistentes. Los pulgones han desarrollado múltiples mecanismos evolutivos en respuesta a las intensas y repetidas presiones antropogénicas en los agroecosistemas, lo que plantea desafíos para la seguridad alimentaria9. Por lo tanto, este método descrito podría extenderse para evaluar posibles aislados de EPF frente a varias especies de pulgones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las crucíferas, un grupo de hortalizas, suelen estar infestadas por múltiples especies de pulgones, como el pulgón de la mostaza (L. erysimi) y el pulgón de la col (Brevicoryne brassicae)26. Ambas especies han sido reportadas en Taiwán27, y es posible que coexistan en el sitio de recolección. Para distinguir especies de pulgones estrechamente relacionadas, este estudio empleó una técnica de identificación molecular utilizando un juego de cebadores…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por 109-2313-B-005-048-MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
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