Inhibition optogénétique de la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 couplée à la mesure de la tension épithéliale chez les embryons de drosophile

Summary

La contractilité de l’actomyosine joue un rôle important dans la morphogenèse des cellules et des tissus. Cependant, il est difficile de manipuler la contractilité de l’actomyosine in vivo de manière aiguë. Ce protocole décrit un système optogénétique qui inhibe rapidement la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 dans les embryons de drosophile , révélant la perte immédiate de la tension épithéliale après l’inactivation de l’actomyosine in vivo.

Abstract

Les forces contractiles générées par l’actine et la myosine II non musculaire (« contractilité de l’actomyosine ») sont essentielles pour les changements morphologiques des cellules et des tissus à plusieurs échelles de longueur, telles que la division cellulaire, la migration cellulaire, le repliement épithélial et la morphogenèse ramifiée. Une compréhension approfondie du rôle de la contractilité de l’actomyosine dans la morphogenèse nécessite des approches qui permettent l’inactivation rapide de l’actomyosine, ce qui est difficile à réaliser avec les approches génétiques ou pharmacologiques conventionnelles. Le protocole présenté démontre l’utilisation d’un système de dimérisation optogénétique basé sur CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, pour inhiber la contractilité de l’actomyosine dans les embryons de drosophile avec des contrôles temporels et spatiaux précis. Dans ce système, CRY2 est fusionné à la forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN), tandis que CIBN est ancré à la membrane plasmique. La dimérisation médiée par la lumière bleue de CRY2 et de CIBN entraîne une translocation rapide de Rho1DN du cytoplasme à la membrane plasmique, où il inactive l’actomyosine en inhibant Rho1 endogène. De plus, cet article présente un protocole détaillé pour le couplage de l’inactivation de l’actomyosine médiée par l’Opto-Rho1DN avec l’ablation au laser afin d’étudier le rôle de l’actomyosine dans la génération de tension épithéliale lors de la formation du sillon ventral chez la drosophile . Ce protocole peut être appliqué à de nombreux autres processus morphologiques qui impliquent la contractilité de l’actomyosine chez les embryons de drosophile avec des modifications minimales. Dans l’ensemble, cet outil optogénétique est une approche puissante pour disséquer la fonction de contractilité de l’actomyosine dans le contrôle de la mécanique tissulaire lors du remodelage tissulaire dynamique.

Introduction

La contractilité de l’actomyosine, la force contractile exercée par la myosine II non musculaire (ci-après « myosine ») sur le réseau F-actine, est l’une des forces les plus importantes dans la modification de la forme cellulaire et la morphogenèse au niveau tissulaire ^1,2. Par exemple, l’activation de la contractilité de l’actomyosine au niveau du domaine apical des cellules épithéliales entraîne une constriction apicale, ce qui facilite divers processus morphogénétiques, notamment le repliement épithélial, l’extrusion cellulaire, la délamination et la cicatrisation des plaies 3,4,5,6,7 . L’activation de la myosine nécessite la phosphorylation de sa chaîne légère régulatrice. Cette modification atténue la conformation inhibitrice des molécules de myosine, leur permettant de former des faisceaux de filaments de myosine bipolaires avec plusieurs domaines de tête aux deux extrémités. Les filaments bipolaires de myosine entraînent le mouvement anti-parallèle des filaments d’actine et entraînent la génération de la force contractile ^1,8,9.

La petite GTPase RhoA (Rho1 chez la drosophile), conservée au cours de l’évolution, joue un rôle central dans l’activation de la contractilité de l’actomyosine dans divers contextes cellulaires^10,11. Rho1 fonctionne comme un commutateur bimoléculaire en se liant soit au GTP (forme active), soit au GDP (forme inactive)¹². Le cycle entre Rho1 lié au GTP ou au GDP est régulé par ses protéines activatrices de la GTPase (GAPs) et ses facteurs d’échange de nucléotides de guanine (GEF)¹³. Les FEM ont pour fonction de faciliter l’échange de PIB contre le GTP et d’activer ainsi l’activité de Rho1. Les GAPs, quant à eux, améliorent l’activité GTPase de Rho1 et désactivent ainsi Rho1. La Rho1 activée favorise la contractilité de l’actomyosine en interagissant avec et en activant ses effecteurs en aval, la kinase associée à la Rho (Rok) et la Diaphane¹⁴. Rok induit l’activation de la myosine et la contractilité de l’actomyosine en phosphorylant la chaîne légère régulatrice de la myosine¹⁵. En outre, Rok inhibe également la phosphatase à chaîne légère régulatrice de la myosine, et favorise donc davantage l’assemblage du filament de myosine¹⁶. Rok peut également phosphoryler les kinases LIM, qui, lorsqu’elles sont activées, empêchent le désassemblage de l’actine en phosphorylant et en inhibant le facteur de dépolymérisation de l’actine, la cofiline^17,18. Diaphane est un nucléateur d’actine de la famille des formines qui favorise la polymérisation de l’actine, fournissant une base pour que la myosine interagisse avec 19,20,21.

Alors que les mécanismes cellulaires qui activent la contractilité de l’actomyosine ont été bien élucés, notre compréhension de sa fonction dans la régulation du remodelage dynamique des tissus reste incomplète. Pour combler cette lacune dans les connaissances, il faut des approches capables d’inactiver rapidement l’actomyosine dans des régions tissulaires spécifiques in vivo et d’enregistrer l’impact immédiat sur le comportement et les propriétés des tissus. Ce protocole décrit l’utilisation d’une approche optogénétique pour inhiber de manière aiguë la contractilité de l’actomyosine lors de l’invagination du mésoderme de la drosophile, suivie d’une mesure de la tension épithéliale par ablation laser. Au cours de la gastrulation de la drosophile, les cellules précurseurs du mésoderme localisées ventralement subissent une constriction apicale et s’invaginent à partir de la surface de l’embryon en formant un sillon orienté antéro-postérieur^22,23. La formation des sillons ventraux a longtemps servi de modèle pour étudier le mécanisme du repliement épithélial. La formation du sillon ventral est administrée par le système de structuration dorsale-ventrale chez la drosophile^24,25,26,27. L’expression de deux facteurs de transcription, Twist et Snail, situés sur la face ventrale de l’embryon, contrôle la formation du sillon ventral et spécifie le devenir des cellules mésodermiques²⁸. Twist et Snail activent le recrutement du Rho1 GEF RhoGEF2 à l’apex des cellules précurseurs du mésoderme via une voie de récepteur couplé à la protéine G et une protéine adaptatrice RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Ensuite, RhoGEF2 active la myosine sur toute la surface apicale du mésoderme potentiel par la voie de la kinase Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La myosine activée forme un réseau d’actomyosine supracellulaire sur toute la surface apicale du primordium du mésoderme, dont les contractions entraînent une constriction apicale et entraînent une augmentation rapide de la tension du tissu apical 14,37,40.

L’outil optogénétique décrit dans ce protocole, Opto-Rho1DN, inhibe la contractilité de l’actomyosine par le recrutement par membrane plasmique dépendante de la lumière bleue d’une forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Une mutation T19N dans Rho1DN élimine la capacité de la protéine mutante à échanger du GDP contre du GTP et rend ainsi la protéine perpétuellement inactive³⁴. Une mutation subséquente de Rho1DN, C189Y, élimine sa membrane naïve ciblant le signal^42,43. Lorsque Rho1DN est perfusé à la membrane plasmique, il se lie aux GEF Rho1 et les retient aussi, bloquant ainsi l’activation de Rho1 ainsi que l’activation médiée par Rho1 de la myosine et de l’actine^34,44. Le recrutement de Rho1DN par membrane plasmique est réalisé grâce à un module de dimérisation dépendant de la lumière dérivé de Cryptochrome 2 et de son partenaire de liaison CIB1. Le cryptochrome 2 est un photorécepteur du cryptochrome activé par la lumière bleue chez Arabidopsis thaliana⁴⁵. Le cryptochrome 2 se lie à CIB1, une protéine basique hélice-boucle-hélice, uniquement dans son état photoexcité⁴⁵. Il a été constaté plus tard que la région d’homologie de la photolyase (PHR) N-terminale conservée du cryptochrome 2 (CRY2_PHR, ci-après dénommée CRY2) et le domaine N-terminal (aa 1-170) de CIB1 (ci-après CIBN) sont importants pour la dimérisation induite par la lumière⁴⁶. Opto-Rho1DN contient deux composants. Le premier composant est la protéine CIBN fusionnée avec une ancre CAAX, qui localise la protéine dans la membrane plasmique⁴⁷. Le deuxième composant est le CRY2 marqué mCherry fusionné avec Rho1DN⁴¹. En l’absence de lumière bleue, CRY2-Rho1DN reste dans le cytoplasme. Lors de la stimulation par la lumière bleue, CRY2-Rho1DN est ciblé sur la membrane plasmique grâce à l’interaction entre le CIBN ancré dans la membrane et le CRY2 excité. L’Opto-Rho1DN peut être activé par la lumière ultraviolette A (UVA) et la lumière bleue (400-500 nm, pic d’activation à 450-488 nm), ou par un laser pulsé de 830-980 nm lors de la stimulation à deux photons^41,46,47,48. Par conséquent, l’Opto-Rho1DN est stimulé par des longueurs d’onde normalement utilisées pour exciter la GFP (488 nm pour l’imagerie à photon unique et 920 nm pour l’imagerie à deux photons). En revanche, les longueurs d’onde couramment utilisées pour exciter mCherry (561 nm pour l’imagerie à photon unique et 1 040 nm pour l’imagerie à deux photons) ne stimulent pas le module optogénétique et peuvent donc être utilisées pour l’imagerie de pré-stimulation. Le protocole décrit les approches utilisées pour minimiser le risque de stimulation non désirée lors de la manipulation de l’échantillon.

L’ablation au laser a été largement utilisée pour détecter et mesurer la tension dans les cellules et les tissus⁴⁹. Des études antérieures ont montré que, lorsque l’intensité du laser est correctement contrôlée, l’ablation au laser à deux photons utilisant un laser femtoseconde proche infrarouge peut altérer physiquement certaines structures subcellulaires (par exemple, les réseaux corticaux d’actomyosine) sans provoquer d’extase de la membrane plasmique^50,51. Si le tissu est sous tension, l’ablation au laser d’une région d’intérêt à l’intérieur du tissu entraîne un recul immédiat vers l’extérieur des cellules adjacentes à la région ablatée. La vitesse de recul est fonction de l’amplitude de la tension et de la viscosité du milieu (cytoplasme) entourant les structures subissant le recul⁴⁹. En raison de la profondeur de pénétration supérieure des lasers dans le proche infrarouge et de la capacité à réaliser une ablation focale bien confinée, l’ablation laser à deux photons est particulièrement utile pour détecter la tension tissulaire in vivo. Comme démontré dans ce protocole, cette méthode peut être facilement combinée avec l’inactivation de la contractilité de l’actomyosine médiée par Opto-Rho1DN pour étudier l’impact direct de la contractilité cellulaire dépendante de Rho1 sur la mécanique tissulaire lors du remodelage dynamique des tissus.

Protocol

1. Mise en place du croisement génétique et préparation du gobelet de collecte des ovules Sélectionner les mouches femelles (vierges) de la lignée optogénétique UASp-CIBNpm (I) ; UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) sur un tampon de CO2 sous un stéréomicroscope et mise en place d’un croisement avec des mouches mâles de la lignée maternelle GAL4 67 Sqh-mCherry ; 15 E-cadhérine-GFP.NOTE : Les 67 et 15 représentent la tubuline maternelle-GAL4 insérée dans les deuxième (…

Representative Results

Chez les embryons non stimulés subissant une constriction apicale, Sqh-mCherry s’est enrichi au niveau de la région médioapicale des cellules mésodermiques ventrales, tandis que CRY2-Rho1DN-mCherry était cytosolique (Figure 1A). L’ablation au laser dans le domaine de constriction a conduit à un recul rapide des tissus le long de l’axe A-P (Figure 1B,C). Dans les embryons stimulés, le signal CRY2-Rho1DN-mCherry est devenu localisé d…

Discussion

Ce protocole décrivait l’utilisation combinée de l’optogénétique et de l’ablation au laser pour sonder les changements de tension tissulaire immédiatement après l’inactivation de la contractilité de l’actomyosine. L’outil optogénétique décrit ici tire parti de la forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN) pour inhiber de manière aiguë la contractilité endogène de l’actomyosine dépendante de Rho1 et de Rho1. La caractérisation antérieure d’Opto-Rho1DN dans le contexte de la formation du si…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation