ड्रोसोफिला भ्रूण में उपकला तनाव के माप के साथ युग्मित Rho1-मध्यस्थ एक्टोमायोसिन सिकुड़न का ऑप्टोजेनेटिक निषेध
Summary
एक्टोमायोसिन सिकुड़न कोशिका और ऊतक मोर्फोजेनेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, विवो में एक्टोमायोसिन सिकुड़न को तीव्र रूप से हेरफेर करना चुनौतीपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल एक ऑप्टोजेनेटिक प्रणाली का वर्णन करता है जो ड्रोसोफिला भ्रूण में Rho1-मध्यस्थता एक्टोमायोसिन संकुचन को तेजी से रोकता है, जिससे विवो में एक्टोमायोसिन की निष्क्रियता के बाद उपकला तनाव के तत्काल नुकसान का पता चलता है।
Abstract
एक्टिन और गैर-मांसपेशी मायोसिन II (“एक्टोमायोसिन कॉन्ट्रैक्टिलिटी”) द्वारा उत्पन्न सिकुड़ा हुआ बल कई लंबाई के पैमाने पर कोशिकाओं और ऊतकों के रूपात्मक परिवर्तनों के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि कोशिका विभाजन, कोशिका प्रवास, उपकला तह और ब्रांचिंग मोर्फोजेनेसिस। मॉर्फोजेनेसिस में एक्टोमायोसिन सिकुड़न की भूमिका की गहन समझ के लिए उन दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है जो एक्टोमायोसिन की तेजी से निष्क्रियता की अनुमति देते हैं, जो पारंपरिक आनुवंशिक या औषधीय दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के साथ ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्टोमायोसिन सिकुड़न को रोकने के लिए एक CRY2-CIBN आधारित ऑप्टोजेनेटिक डिमराइजेशन सिस्टम, Opto-Rho1DN के उपयोग को प्रदर्शित करता है। इस प्रणाली में, CRY2 को Rho1 (Rho1DN) के प्रमुख नकारात्मक रूप से जोड़ा जाता है, जबकि CIBN को प्लाज्मा झिल्ली पर लंगर डाला जाता है। CRY2 और CIBN के ब्लू लाइट-मध्यस्थता डिमराइजेशन के परिणामस्वरूप साइटोप्लाज्म से प्लाज्मा झिल्ली तक Rho1DN का तेजी से स्थानांतरण होता है, जहां यह अंतर्जात Rho1 को रोककर एक्टोमायोसिन को निष्क्रिय कर देता है। इसके अलावा, यह लेख ड्रोसोफिला वेंट्रल कुंड गठन के दौरान उपकला तनाव उत्पन्न करने में एक्टोमायोसिन की भूमिका की जांच करने के लिए लेजर एब्लेशन के साथ एक्टोमायोसिन की ऑप्टो-Rho1DN-मध्यस्थता निष्क्रियता को युग्मित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल को कई अन्य रूपात्मक प्रक्रियाओं पर लागू किया जा सकता है जिसमें न्यूनतम संशोधनों के साथ ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्टोमायोसिन सिकुड़न शामिल है। कुल मिलाकर, यह ऑप्टोजेनेटिक उपकरण गतिशील ऊतक रीमॉडेलिंग के दौरान ऊतक यांत्रिकी को नियंत्रित करने में एक्टोमायोसिन सिकुड़न के कार्य को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है।
Introduction
एक्टोमायोसिन सिकुड़न, एफ-एक्टिन नेटवर्क पर गैर-मांसपेशी मायोसिन II (इसके बाद ‘मायोसिन’) द्वारा लगाया गया सिकुड़ा हुआ बल, सेल आकार को बदलने और ऊतक-स्तर मॉर्फोजेनेसिस 1,2 को चलाने में सबसे महत्वपूर्ण बलों में से एक है। उदाहरण के लिए, उपकला कोशिकाओं के एपिकल डोमेन में एक्टोमायोसिन सिकुड़न के सक्रियण के परिणामस्वरूप एपिकल कसना होता है, जो उपकला तह, सेल एक्सट्रूज़न, डिलेमिनेशन और घाव भरने सहित विभिन्न मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है।. मायोसिन के सक्रियण के लिए इसकी नियामक प्रकाश श्रृंखला के फॉस्फोराइलेशन की आवश्यकता होती है। यह संशोधन मायोसिन अणुओं के निरोधात्मक रचना को कम करता है, जिससे उन्हें दोनों सिरों पर कई सिर डोमेन के साथ द्विध्रुवी मायोसिन फिलामेंट बंडल बनाने की अनुमति मिलती है। द्विध्रुवी मायोसिन फिलामेंट्स एक्टिन फिलामेंट्स के विरोधी समानांतर आंदोलन को चलाते हैं और परिणामस्वरूप सिकुड़ा हुआ बल 1,8,9 उत्पन्न होता है।
क्रमिक रूप से संरक्षित Rho परिवार छोटा GTPase RhoA (ड्रोसोफिला में Rho1) विभिन्न सेलुलर संदर्भों में एक्टोमायोसिन सिकुड़न के सक्रियण में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। Rho1 जीटीपी (सक्रिय रूप) या जीडीपी (निष्क्रिय रूप) 12 को बांधकर एक द्वि-आणविक स्विच के रूप में कार्य करता है। जीटीपी- या जीडीपी-बाउंड Rho1 के बीच साइक्लिंग को इसके GTPase-सक्रिय प्रोटीन (GAPs) और गुआनिन न्यूक्लियोटाइड-एक्सचेंज फैक्टर्स (GEFs) 13 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। जीईएफ जीटीपी के लिए जीडीपी के आदान-प्रदान को सुविधाजनक बनाने के लिए कार्य करते हैं और इस प्रकार Rho1 गतिविधि को सक्रिय करते हैं। दूसरी ओर, जीएपी, Rho1 की GTPase गतिविधि को बढ़ाते हैं और इस प्रकार Rho1 को निष्क्रिय करते हैं। सक्रिय Rho1 अपने डाउनस्ट्रीम प्रभावकों, Rho-संबद्ध काइनेज (Rok) और डायफेनस14 के साथ बातचीत और सक्रिय करके एक्टोमायोसिन सिकुड़न को बढ़ावा देता है। रोक मायोसिन15 की नियामक प्रकाश श्रृंखला को फॉस्फोराइलेट करके मायोसिन सक्रियण और एक्टोमायोसिन सिकुड़न को प्रेरित करता है। इसके अलावा, रोक मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला फॉस्फेट को भी रोकता है, और इसलिए मायोसिन फिलामेंट असेंबली16 को बढ़ावा देता है। रोक एलआईएम किनेसेस को फॉस्फोराइलेट भी कर सकता है, जो सक्रिय होने पर, एक्टिन-डिपोलीमराइजेशन कारक कोफिलिन17,18 को फॉस्फोराइलेट और बाधित करके एक्टिन विघटन को रोकता है। डायफेनस एक फॉर्मिन परिवार एक्टिन न्यूक्लिएटर है जो एक्टिन पोलीमराइजेशन को बढ़ावा देता है, जो मायोसिन को 19,20,21 के साथ बातचीत करने के लिए एक आधार प्रदान करता है।
जबकि एक्टोमायोसिन सिकुड़न को सक्रिय करने वाले सेलुलर तंत्र को अच्छी तरह से स्पष्ट किया गया है, गतिशील ऊतक रीमॉडेलिंग को विनियमित करने में इसके कार्य की हमारी समझ अधूरी है। इस ज्ञान अंतर को भरने के लिए ऐसे दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है जो विवो में विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों में एक्टोमायोसिन को तेजी से निष्क्रिय कर सकते हैं और ऊतक व्यवहार और गुणों पर तत्काल प्रभाव रिकॉर्ड कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेसोडर्म इनवेजाइनेशन के दौरान एक्टोमायोसिन सिकुड़न को तीव्र रूप से रोकने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के उपयोग का वर्णन करता है, इसके बाद लेजर एब्लेशन का उपयोग करके उपकला तनाव का माप होता है। ड्रोसोफिला गैस्ट्रुलेशन के दौरान, उदर स्थानीयकृत मेसोडर्म अग्रदूत कोशिकाएं भ्रूण की सतह से एपिकल कसना और इनवेजाइनेट से गुजरती हैं, जिससे एक पूर्वकाल-पीछे उन्मुख कुंड22,23 बनता है। वेंट्रल कुंड का गठन लंबे समय से उपकला तह के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। ड्रोसोफिला24,25,26,27 में पृष्ठीय-उदर पैटर्निंग प्रणाली द्वारा वेंट्रल कुंड गठन को प्रशासित किया जाता है। भ्रूण के उदर पक्ष में स्थित दो प्रतिलेखन कारकों, ट्विस्ट और स्नेल की अभिव्यक्ति, उदर कुंड गठन को नियंत्रित करती है और मेसोडर्मल सेल भाग्य28 को निर्दिष्ट करती है। ट्विस्ट और स्नेल एक जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर मार्ग और एक RhoGEF2 एडाप्टर प्रोटीन, T48 29,30,31,32,33 के माध्यम से मेसोडर्म अग्रदूत कोशिकाओं के शीर्ष पर Rho1 GEF RhoGEF2 की भर्ती को सक्रिय करते हैं। इसके बाद, RhoGEF2 Rho-Rho kinese मार्ग 34,35,36,37,38,39 के माध्यम से संभावित मेसोडर्म की एपिकल सतह में मायोसिन को सक्रिय करता है। सक्रिय मायोसिन मेसोडर्म प्रिमोडियम की एपिकल सतह पर एक सुपरसेलुलर एक्टोमायोसिन नेटवर्क बनाता है, जिसके संकुचन एपिकल कसना को चलाते हैं और परिणामस्वरूप एपिकल ऊतक तनाव 14,37,40 में तेजी से वृद्धि होती है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऑप्टोजेनेटिक उपकरण, ऑप्टो-Rho1DN, Rho1 (Rho1DN)41 के एक प्रमुख नकारात्मक रूप के ब्लू-लाइट निर्भर प्लाज्मा झिल्ली भर्ती के माध्यम से एक्टोमायोसिन सिकुड़न को रोकता है। Rho1DN में एक T19N उत्परिवर्तन जीटीपी के लिए GDP का आदान-प्रदान करने के लिए उत्परिवर्ती प्रोटीन की क्षमता को समाप्त कर देता है और इस प्रकार प्रोटीन कोलगातार निष्क्रिय कर देता है। Rho1DN, C189Y में एक बाद का उत्परिवर्तन, इसके भोले झिल्ली लक्ष्यीकरण संकेत42,43 को समाप्त कर देता है। जब Rho1DN को प्लाज्मा झिल्ली से जोड़ा जाता है, तो यह Rho1 GEFs को बांधता है और रोकता है, जिससे Rho1 के सक्रियण के साथ-साथ मायोसिन और एक्टिन34,44 के Rho1-मध्यस्थता सक्रियण को अवरुद्ध किया जाता है। Rho1DN की प्लाज्मा झिल्ली भर्ती क्रिप्टोक्रोम 2 और इसके बाध्यकारी भागीदार CIB1 से प्राप्त एक प्रकाश-निर्भर डिमराइजेशन मॉड्यूल के माध्यम से प्राप्त की जाती है। क्रिप्टोक्रोम 2 एराबिडोप्सिस थैलियाना45 में एक ब्लू-लाइट सक्रिय क्रिप्टोक्रोम फोटोरिसेप्टर है। क्रिप्टोक्रोम 2 सीआईबी 1, एक बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स प्रोटीन को बांधता है, केवल इसकी फोटोउत्तेजित अवस्था45 में। बाद में यह पाया गया कि क्रिप्टोक्रोम 2 (CRY2 PHR, जिसे बाद में CRY2 के रूप में संदर्भित किया जाता है) से संरक्षित एन-टर्मिनल, फोटोलाइस होमोलॉजी क्षेत्र (PHR), और CIB1 (इसके बाद CIBN) के N-टर्मिनल डोमेन (aa 1-170) प्रकाश-प्रेरित डिमराइजेशन46 के लिए महत्वपूर्ण हैं। Opto-Rho1DN में दो घटक होते हैं। पहला घटक सीएएएक्स एंकर के साथ जुड़ा हुआ सीआईबीएन प्रोटीन है, जो प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली47 में स्थानीयकृत करता है। दूसरा घटक mCherry-टैग किया गया CRY2 है जो Rho1DN41 के साथ जुड़ा हुआ है। नीली रोशनी की अनुपस्थिति में, CRY2-Rho1DN साइटोप्लाज्म में रहता है। नीली रोशनी उत्तेजना पर, CRY2-Rho1DN को झिल्ली-लंगर वाले CIBN और उत्तेजित CRY2 के बीच बातचीत के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली पर लक्षित किया जाता है। ऑप्टो-Rho1DN को पराबैंगनी ए (यूवीए) प्रकाश और नीली रोशनी (400-500 एनएम, 450-488 एनएम पर पीक सक्रियण) या दो-फोटॉन उत्तेजना41,46,47,48 करते समय 830-980 एनएम स्पंदित लेजर द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। इसलिए, ऑप्टो-Rho1DN को आमतौर पर रोमांचक जीएफपी (एकल फोटॉन इमेजिंग के लिए 488 एनएम और दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए 920 एनएम) के लिए उपयोग किए जाने वाले तरंग दैर्ध्य द्वारा उत्तेजित किया जाता है। इसके विपरीत, आमतौर पर रोमांचक एमचेरी के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य (एकल फोटॉन इमेजिंग के लिए 561 एनएम और दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए 1,040 एनएम) ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूल को उत्तेजित नहीं करती है और इसलिए इसका उपयोग पूर्व-उत्तेजना इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल नमूना हेरफेर के दौरान अवांछित उत्तेजना के जोखिम को कम करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों का वर्णन करता है।
कोशिकाओं और ऊतकों में तनाव का पता लगाने औरमापने के लिए लेजर एब्लेशन को बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि, जब लेजर तीव्रता को उचित रूप से नियंत्रित किया जाता है, तो फेम्टोसेकंड नियर-इन्फ्रारेड लेजर को नियोजित करने वाला दो-फोटॉन लेजर एब्लेशन कुछ उपकोशिकीय संरचनाओं (जैसे, कॉर्टिकल एक्टोमायोसिन नेटवर्क) को शारीरिक रूप से खराब कर सकता है, जिससे प्लाज्मा झिल्ली50,51 हो सकती है। यदि ऊतक तनाव में है, तो ऊतक के भीतर रुचि के क्षेत्र के लेजर पृथक्करण के परिणामस्वरूप एब्लेटेड क्षेत्र से सटे कोशिकाओं का तत्काल बाहरी पुनरावृत्ति होता है। पुनरावृत्ति वेग तनाव के परिमाण और पुनरावृत्ति49 से गुजरने वाली संरचनाओं के आसपास मीडिया (साइटोप्लाज्म) की चिपचिपाहट का एक कार्य है। निकट-अवरक्त लेजर की बेहतर प्रवेश गहराई और अच्छी तरह से सीमित फोकल एब्लेशन प्राप्त करने की क्षमता के कारण, दो-फोटॉन लेजर एब्लेशन विवो में ऊतक तनाव का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया है, इस विधि को गतिशील ऊतक रीमॉडेलिंग के दौरान ऊतक यांत्रिकी पर Rho1-निर्भर सेलुलर सिकुड़न के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच करने के लिए एक्टोमायोसिन अनुबंध की ऑप्टो-Rho1DN-मध्यस्थता निष्क्रियता के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ने एक्टोमायोसिन संकुचन की निष्क्रियता के तुरंत बाद ऊतक तनाव में परिवर्तन की जांच के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स और लेजर एब्लेशन के संयुक्त उपयोग का वर्णन किया। यहां वर्णित ऑप्टोजेनेटिक उपकरण Rho1 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इमेजिंग समर्थन के लिए एन लावनवे को धन्यवाद देते हैं। लेखक अभिकर्मकों को साझा करने के लिए विस्चौस प्रयोगशाला और डी रेनजिस प्रयोगशाला और फ्लाई स्टॉक के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर को धन्यवाद देते हैं। यह अध्ययन एनआईजीएमएस ईएसआई-एमआईआरए R35GM128745 और अमेरिकन कैंसर सोसाइटी इंस्टीट्यूशनल रिसर्च ग्रांट #IRG-82-003-33 द्वारा बीएच को समर्थित है।
Materials
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | Used for sample preparation |
| 60 mm × 15 mm Petri dish with lid | Falcon | 351007 | Used for sample preparation |
| Black cloth for covering the microscope | Online | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) | VWR | 10028-048 | Used for embryo dechorination |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Used for cross set-up |
| ddH2O | NA | NA | Used for sample preparation |
| Dumont Style 5 tweezers | VWR | 102091-654 | Used for sample preparation |
| Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) | VWR | 22940-834 | Used for sample preparation |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| Halocarbon oil 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Used for embryo stage visualization |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Used for image analysis |
| MATLAB | MathWorks | NA | Used for image analysis |
| Nikon SMZ-745 stereoscope | Nikon | NA | Used for sample preparation |
| Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) | VWR | 30621-392 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) | Bolioptics | FM14036151 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights | Amazon | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
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