Den nåværende protokollen fremhever en modifisert metode for å oppdage og kvantifisere DNA-protein-kryssbindinger (DPC) og deres posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM), inkludert ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering indusert av topoisomerasehemmere og av formaldehyd, og dermed tillate studiet av dannelse og reparasjon av DPC og deres PTM.
DNA-protein-tverrbindinger (DPC) er hyppige, allestedsnærværende og skadelige DNA-lesjoner, som oppstår ved endogen DNA-skade, enzym (topoisomeraser, metyltransferaser, etc.) som ikke fungerer, eller eksogene midler som kjemoterapeutika og kryssbindingsmidler. Når DPC er indusert, blir flere typer posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) raskt konjugert til dem som tidlige responsmekanismer. Det har vist seg at DPCer kan modifiseres av ubiquitin, liten ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) og poly-ADP-ribose, som primer substratene for å signalisere deres respektive utpekte reparasjonsenzymer og i noen tilfeller koordinere reparasjonen i sekvensielle måter. Siden PTM-er kommer raskt og er svært reversible, har det vært utfordrende å isolere og oppdage PTM-konjugerte DPC-er som vanligvis forblir på lave nivåer. Presentert her er en immunoassay for å rense og kvantitativt oppdage ubiquitylerte, SUMOylerte og ADP-ribosylerte DPCer (legemiddelinduserte topoisomerase DPCer og aldehydinducerte ikke-spesifikke DPCer) in vivo. Denne analysen er avledet fra RADAR-analysen (rapid approach to DNA adduct recovery) som brukes til isolering av genomisk DNA som inneholder DPC ved etanolutfelling. Etter normalisering og nukleasefordøyelse detekteres PTM av DPCer, inkludert ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering, ved immunoblotting ved bruk av deres tilsvarende antistoffer. Denne robuste analysen kan brukes til å identifisere og karakterisere nye molekylære mekanismer som reparerer enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer og har potensial til å oppdage småmolekylære hemmere rettet mot spesifikke faktorer som regulerer PTM for å reparere DPCer.
Genomisk DNA-skade oppstår på grunn av spontant forfall, indre skader og miljøfaktorer1. De resulterende DNA-lesjonene omfatter skadede baser, uoverensstemmelser, enkelt- og dobbeltstrengbrudd, tverrbindinger mellom og mellom tråder og DNA-protein-tverrbindinger (DPC). En DPC dannes når et kromatinbundet protein er fanget på DNA gjennom kovalent kobling. DPCer induseres av endogene DNA-lesjoner og reaktive metabolitter, samt eksogene midler som kjemoterapeutika og bifunksjonelle kryssbindingsmidler. Under visse omstendigheter kan enzymdysfunksjon også føre til dannelse av DPCs2. Den store forskjellen i DPC-induktorer resulterer i en forskjell i identiteten til det kovalente bundne proteinet, kromosomområdet der DPC dannes, strukturtypen av DNA kryssbundet til proteinet og den kjemiske egenskapen til den kovalente koblingen mellom proteinet og DNA 2,3,4.
Basert på deres kjemiske natur, er DPCer generelt kategorisert i to grupper: enzymatiske DPCer og ikke-enzymatiske DPCer. Visse enzymer som topoisomeraser, glykosylaser og metyl / acyltransferaser virker ved å danne reversible enzym-DNA kovalente mellomprodukter under deres normale katalytiske reaksjoner. Disse er kortlivede enzym-DNA-mellomprodukter og kan omdannes til langlivede enzymatiske DPCer ved fangst av endogene eller eksogene midler, spesielt ved kjemoterapeutika3. Topoisomerase DPC er blant de hyppigste enzymatiske DPCene i eukaryote celler, som kan genereres av klinisk nyttige topoisomerasehemmere (topotekan og irinotekan for topoisomerase I [TOP1] og etoposid og doksorubicin for topoisomerase II [TOP2]) og er de primære terapeutiske mekanismene til disse hemmerne 5,6. DNA-metyltransferaser (DNMT) 1, 3A og 3B er målet for 5-aza-2′-deoksycytidin (også kjent som decitabin) og danner DPCer ved eksponering for stoffet7. Reaktive midler, samt ultrafiolett lys og ioniserende stråling, induserer ikke-enzymatiske DPCer ved ikke-spesifikt kryssbindende proteiner til DNA. Reaktive aldehyder som acetaldehyd og formaldehyd (FA) genereres ofte som biprodukter av cellulær metabolisme, blant annet FA produseres ved mikromolære konsentrasjoner under metanolmetabolisme, lipidperoksydasjon og histondemetylering. Dessuten er FA et høyvolum produksjon kjemikalie produsert over hele verden, som mange mennesker er utsatt både miljømessig og yrkesmessig 8,9.
Både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer er svært giftige for celler, da deres store proteinkomponenter effektivt hindrer nesten alle kromatinbaserte prosesser, inkludert replikasjon og transkripsjon, noe som fører til cellesyklusarrest og apoptose hvis de ikke repareres. I løpet av de siste to tiårene har reparasjon av DPC blitt grundig studert, og flere proteiner / veier har blitt identifisert som nøkkelfaktorer som enten direkte reparerer DPC eller modulerer reparasjonsprosessene. For eksempel har det vært veletablert at proteolyse av proteinets hoveddel av en DPC er et sentralt trinn i DPC-reparasjon, og at proteolyse kan katalyseres av proteasene SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 eller 26S proteasomkomplekset 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 på en celletype- eller cellulær kontekstavhengig måte. Identifisering og karakterisering av disse proteasene har i stor grad stått på in vivo-komplekset av enzymet (ICE) analyse28,29 og den raske tilnærmingen til DNA-adduktgjenoppretting (RADAR) analyse30,31, som begge isolerer DNA-molekyler og deres kovalente bundne proteiner fra frie cellulære proteiner for å tillate påvisning av DPCer ved slot-blot ved bruk av antistoffer rettet mot de tverrbundne proteiner. Også den innestengte agarose-DNA-immunfargingsanalysen (TARDIS) ble brukt som et middel til å oppdage og kvantifisere DPCer på enkeltcellenivå32. For tiden velger forskere RADAR-analysen over ICE-analysen for å måle DPCer, da ICE-analysen er avhengig av rensing av nukleinsyrer ved bruk av cesiumkloridgradient-ultrasentrifugering, noe som er ekstremt tidkrevende, mens RADAR-analysen utfeller nukleinsyrer ved bruk av etanol innen en mye kortere periode.
I de senere år har det fremkommet bevis for at flere posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) er involvert i signalering og rekruttering av DPC-målrettede proteaser 3,33,34,35. For eksempel ble både TOP1- og TOP2-DPCer funnet å være konjugert av liten ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) -2/3 og deretter SUMO-1 av SUMO E3-ligasen PIAS4, uavhengig av DNA-replikasjon og transkripsjon. De sekvensielle SUMO-modifikasjonene ser ut til å være et mål for ubiquitin, som er avsatt til SUMOylated TOP-DPCs og danner polymerkjeder gjennom lysin 48-resten av en SUMO-målrettet ubiquitinligase kalt RNF4. Deretter fremkaller ubiquitinpolymeren et signal til og rekrutterer 26S-proteasomet til TOP-DPCs23,36. Den samme SUMO-ubiquitin-banen ble nylig vist å virke på DNMT1-DPCer samt PARP-DNA-komplekser for reparasjon37,38. I tillegg har SUMO-uavhengig ubiquitylering av ubiquitin E3 ligase TRAIP blitt rapportert til prime DPCs for proteasomal nedbrytning på en replikasjonskoblet måte39. I likhet med den proteasomale nedbrytningen av TOP-DPC, krever proteolyse av enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer ved replikasjonskoblet metalloprotease SPRTN også allestedsnærværende av DPC-substratene som en mekanisme for å engasjere SPRTN40,41. Avgrensning av rollen til SUMOylering og ubiquitylering krever deteksjon av DPCer som er merket med disse PTM-ene. Siden den originale ICE-analysen og RADAR-analysen er avhengige av slot-blot / dot-blot-apparat for å måle ufordøyd DNA-prøver, er ingen av disse to analysene i stand til å løse og visualisere PTM-konjugerte DPC-arter med forskjellige molekylvekter. For å overvinne dette problemet fordøyde vi DNA-prøvene etter rensing ved etanolutfelling og prøvenormalisering med mikrokokknuklease, et DNA og RNA endo-eksonuklease for å frigjøre de tverrbundne proteinene, noe som gjorde det mulig for oss å løse proteinene så vel som deres kovalente PTM med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Elektroforesen tillot oss å oppdage og kvantifisere PTM-konjugerte DPCer ved hjelp av spesifikke antistoffer rettet mot PTM-ene. Vi kalte opprinnelig denne forbedrede metoden DUST-analysen, for å markere dens robusthet i påvisning av ubiquitylerte og SUMOylerte TOP-DPCer23. Senere utvidet vi bruken av analysen for kvantitativt å vurdere ADP-ribosylering av TOP1-DPC in vivo, ved bruk av antistoffer mot poly-ADP-ribosepolymerer20.
Presentert her er en detaljert protokoll for analysen som oppdager og måler ubiquitylerte, SUMOylerte og ADP-ribosylerte DPCer, som ble optimalisert for de modifiserte TOP-DPCene som er indusert av deres hemmere og ikke-spesifikke / ikke-enzymatiske DPCer som er indusert av FA. Denne analysen isolerer PTM-konjugerte DPCer ved å lysere celler med et kaotropisk middel, utfelle DNA med etanol og frigjøre de ellers kryssbundne proteinene og deres modifikatorer med mikrokokknuklease. De ellers DNA-bundne proteinene og deres PTM kvantifiseres ved immunblotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Denne analysen baner en ny vei for å belyse de molekylære mekanismene som cellen reparerer både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer. Spesielt muliggjør det detaljerte studier av induksjon og kinetikk av PTM-er som er viktige for regulering av TOP-DPC-nedbrytning og reparasjon, og tillater dermed oppdagelsen av nye faktorer som E3-ligaser som dikterer PTM-ene, samt hemmere rettet mot disse faktorene. Siden noen av PTM-ene som er ansvarlige for TOP-DPC-reparasjon, sannsynligvis er involvert i reparasjon av DPCer indusert av andre kjemoterapeutika, for eksempel platinabaserte legemidler22, har denne analysen også potensial for anvendelse på oppdagelsen av nye stoffer og rasjonell optimalisering av kombinatoriske terapier med topoisomerasehemmere eller platinabaserte antineoplastikker i pasientceller for å veilede behandlingsregimer.
Den beskrevne metoden tillater måling av enzymatiske og ikke-enzymatiske DNA-protein-tverrbindinger i pattedyrceller og er den eneste egnede tilnærmingen for å studere deres ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering. Slot-blotting etter ICE- eller RADAR-analysen tillater rask påvisning av spesifikke enzymatiske DPCer som TOP-DPCer ved bruk av antistoffene. En advarsel til denne metoden er imidlertid dens manglende evne til å skille proteiner med forskjellige molekylvekter, noe som gjør det umulig å bestemme størrelsene på PTM-konjugerte DPCer. Den beskrevne metoden løser problemet ved å frigjøre tverrbundne proteiner med mikrokokknuklease, som nedbryter DNA til oligonukleotider med terminale 3′-fosfater, og derved tillater full separasjon av proteinene (konjugert med oligonukleotider) av SDS-PAGE. DPC-er modifisert med ubiquitin-, SUMO- eller ADP-ribosemonomerer og polymerer av forskjellige størrelser kan derfor visualiseres og kvantifiseres av antistoffer rettet mot disse PTM-ene, noe som muliggjør detaljert undersøkelse av deres dannelse og kinetikk. For å sikre reproduserbarhet og beregne statistisk signifikans kreves biologiske replikater av forsøkene.
Et av de vanligste problemene med denne analysen er lavt DNA-utbytte etter etanolutfelling. På den ene siden kan DNA-utbyttet økes med mer utgangsmateriale (celler). På den annen side kan inkubering av cellelysater med etanol i en flat plate i stedet for et Eppendorf-rør markant forbedre aggregeringen av DNA-molekyler og dermed lette nedbøren. Uspesifikke signaler observert i prøver uten medikamentell behandling kan indikere ikke-kovalent proteinkontaminering. Hvis dette er tilfelle, kan man vurdere å vaske DNA-pellets med høy saltbuffer for å fjerne forurensningene før sonikering. Det anbefales også å spinne ned DNA-prøver etter sonikering og mikrokokknukleasefordøyelse og kaste bort uoppløselig. Ved dårlig eller intet signal kan flere mulige løsninger forsøkes. For det første kan man øke belastningsmengden av DNA for SDS-PAGE og immunoblotting. For å gjøre SUMOylerte og allestedsnærværende DPC-arter detekterbare, anbefales det å laste minst 4 μg DNA på gelen. For det andre kan man øke stoffkonsentrasjonene for å indusere høyere nivåer av DPCer og deres tilknyttede PTM. For det tredje foreslås det å inkubere flekker med primære antistoffer i en annen dag hvis bånd / utstryk ser ut til å være svake. En 2-dagers inkubasjon kan forsterke signalet betydelig og dermed redusere biologisk variabilitet fra uavhengige eksperimenter23. Membranstripping for re-farging resulterer uunngåelig i tap av en viss mengde PTM-konjugerte DPC-arter som allerede er i lav overflod. Derfor anbefales det sterkt å kjøre separate geler for ubiquitin og SUMO-deteksjon i stedet for å undersøke en flekk på nytt. I tillegg må DNA-pellets vaskes med 75% etanol for å fjerne det gjenværende DNAzol som inneholder guanidinsalt før oppløsning i H2O eller andre løsningsmidler, som ellers forårsaker krystallisering av prøven etter tilsetning av Laemmli lastbuffer.
Arbeidsflyten til den beskrevne metoden er mye mer tidseffektiv sammenlignet med den besværlige ICE-analysen, da den er avhengig av rask etanolutfelling i stedet for den tidkrevende cesiumklorid-ultrasentrifugeringen for å isolere genomisk DNA. Til en pris gir etanolbasert rensing en lav mengde proteinforurensninger som normalt er ubetydelige for immundeteksjon. Men når det gjelder analytiske studier, for eksempel massespektrometribasert proteomisk analyse eller neste generasjons sekvensering som krever nøyaktighet og presisjon, er cesiumkloridtetthet-gradientsentrifugering fortsatt en mer pålitelig tilnærming for å isolere rent, høyt overflod DNA. Denne metoden kan også potensielt brukes til profilering av modifikasjonssteder på kryssbundne proteiner og bestemmelse av koblingstyper av poly-ubiquitylering og poly-SUMOylering ved bruk av riktige massespektrometribaserte metoder.
Merk at denne analysen tillater identifisering og karakterisering av faktorer som regulerer PTM-er for DPC-reparasjon. For eksempel er objektive screeningsmetoder med høy gjennomstrømning (RNA-interferens og CRISPR) kraftige verktøy for å oppdage ubiquitin E3-ligaser, SUMO E3-ligaser og tilhørende kofaktorer som reduserer cytotoksisiteten til DPC-induktorer. Den beskrevne metoden muliggjør molekylær validering av disse proteinene ved å bestemme om de hjelper celler å overleve DPC-induktorer ved å reparere DPC-ene. Nye småmolekylære hemmere rettet mot disse proteinene identifisert, for eksempel ved virtuell screening, kan også valideres ved hjelp av denne protokollen. Gitt at topoisomerasehemmere er blant de mest foreskrevne kjemoterapeutika, kan denne robuste analysen utvikles som et verktøy for utvikling av legemidler som synergiserer med kliniske topoisomerasehemmere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence i Postdoctoral Research Transition Award.
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |