यहां, प्रकाशिकी-आधारित मंच का उपयोग करके मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में संकुचन और कैल्शियम माप करने के लिए एक स्थापित विधि का वर्णन किया गया है। यह मंच शोधकर्ताओं को उत्परिवर्तन के प्रभाव और विभिन्न उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से अध्ययन करने में सक्षम बनाता है।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएस-सीएम) कार्डियोमायोसाइट्स फ़ंक्शन में उत्परिवर्तन-मध्यस्थता परिवर्तनों का अध्ययन करने और तनाव और दवा हस्तक्षेप के प्रभावों को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया है कि यह प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली 2 डी में एचआईपीएस-सीएम के कार्यात्मक मापदंडों का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके, विभिन्न प्लेट लेआउट पर एक अच्छी तरह से संरक्षित तापमान वातावरण में युग्मित माप करना संभव है। इसके अलावा, यह प्रणाली शोधकर्ताओं को तत्काल डेटा विश्लेषण प्रदान करती है।
यह पेपर असंशोधित HIPSC-CM की संविदात्मकता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संकुचन कैनेटीक्स को 250 हर्ट्ज नमूना आवृत्ति पर विश्राम पर लिए गए संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष पिक्सेल सहसंबंध परिवर्तनों के आधार पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा जाता है। इसके अतिरिक्त, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिकों के एक साथ माप को कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोफोरे के साथ सेल को लोड करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि फुरा -2। हाइपरस्विच का उपयोग करके, अनुपातमीट्रिक कैल्शियम माप को 50 μm व्यास रोशनी स्थान पर किया जा सकता है, जो अनुबंध माप के क्षेत्र के अनुरूप है।
दिल की विफलता दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है। 2019 में, कार्डियोवैस्कुलर बीमारी ने विश्व स्तर पर 18.6 मिलियन मौतों का कारण बना, जोपिछले दशक 1 में 17.1% की वृद्धि को दर्शाता है। दिल की विफलता को रोकने और ठीक करने के लिए दवा लक्ष्यों की पहचान करने के शोधकर्ताओं के प्रयासों के बावजूद, रोगी के परिणाम अभीभी खराब हैं। मनुष्यों के संबंध में पशु मॉडल के पैथोफिज़ियोलॉजी में अंतर दिल कीविफलता चिकित्सा के अनुकूलन के लिए सीमित सफलता में अंतर्निहित कारकों में से एक हो सकता है। अतिरिक्त मानव-जैसे मॉडल को बीमारी के मॉडल और नए दवा यौगिकों की विषाक्तता और प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए वारंट किया जाता है।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएस-सीएम) तनाव, इस्किमिया, परिवर्तित चयापचय, या रोगजनक जीन वेरिएंट औरदवा हस्तक्षेप की प्रभावशीलता और विषाक्तता से प्रेरित सेलुलर पैथोमैकेनिज्म को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। एचआईपीएस-सीएम के कार्यात्मक गुणों पर प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, एक उच्च गति प्रणाली जो एक निष्पक्ष और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से सेलुलर संकुचन के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक गुणों को मापती है। वर्तमान अध्ययन का यह समग्र लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि एक प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली एचआईपीएस-सीएम के कार्यात्मक मापदंडों के वास्तविक समय के विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
वर्तमान में, HIPSC-CM के अनुबंध का मूल्यांकन करने के लिए कई प्लेटफ़ॉर्म हैं। हालांकि, वर्तमान सिस्टम या तो धीमी गति से रीडआउट प्रदान करते हैं, या कोशिकाओं की आवश्यक संख्या एक चुनौती हो सकती है। लेबल-मुक्त वीडियो माप प्रणाली5,6 वीडियो के पोस्ट-हॉक विश्लेषण पर भरोसा करती है, जिसके लिए बहुत अधिक भंडारण की आवश्यकता होती है और वीडियो अधिग्रहण के दौरान प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया का अभाव होता है। इसके अलावा, पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्राप्त करना कठिन है, और इसके परिणामस्वरूप अंडरसैंपलिंग हो सकती है। कार्डियोमायोसाइट्स गुणों को निर्धारित करने के अन्य तरीके, जैसे कि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)/सीएएस 9-संपादित एचआईपीएस-सीएम7 कोशिकाओं की जीन स्थिरता में हस्तक्षेप कर सकते हैं और विशेष प्रयोगशाला विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।
ऊपर उल्लिखित सीमाओं को दूर करने के लिए, इस अध्ययन में एक अद्वितीय प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली विकसित और पेश की गई थी। यह प्लेटफ़ॉर्म प्लेट आकार में किसी भी सीमा के बिना, किसी भी आवश्यक प्लेट प्रारूप पर उन्हें रीप्लेट करके असंशोधित एचआईपीएस-सीएम पर अनुबंध माप को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, वास्तविक समय माप HIPSC-CM के कार्यात्मक मापदंडों के प्रत्यक्ष अवलोकन और विश्लेषण की अनुमति देते हैं, और इस प्रकार प्रोटोकॉल को तुरंत समायोजित और अनुकूलित करने के लिए एक प्रयोगात्मक सेटिंग प्रदान करते हैं। इसके अलावा, प्रत्येक माप का स्थान संग्रहीत किया जाता है, जो एक ही नमूने पर युग्मित माप को सक्षम करता है, जिससे प्रयोगों की शक्ति बढ़ जाती है।
प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली का प्रदर्शन करने के लिए, अनुबंध माप एक नियंत्रण HIPSC-CM लाइन पर किया गया था। यह नियंत्रण एचआईपीएस लाइन एक सामान्य कैरियोटाइप8 के साथ एक स्वस्थ पुरुष दाता के त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से उत्पन्न हुई थी। संकुचन कैनेटीक्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया था, जो 250 हर्ट्ज नमूना आवृत्ति पर विश्राम के दौरान लिए गए संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष पिक्सेल सहसंबंध परिवर्तनों पर आधारित था। चूंकि संकुचन की सटीक शुरुआत हमेशा स्पष्ट रूप से निर्धारित नहीं की जा सकती है, जिस समय बिंदु पर शिखर ऊंचाई का 20% (समय से शिखर 20%) तक पहुंच गया था, उसे चरम पर समय के माप के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में लिया गया था। ऐसा करने से, एक नमूने के भीतर इस पैरामीटर के लिए कम परिवर्तनशीलता पाई गई। इसी तरह, जैसा कि सटीक क्षण जिस पर सिग्नल बेसलाइन पर लौटता है, उसका आकलन करना मुश्किल है, विश्राम समय का वर्णन करने के लिए पीक (समय से बेसलाइन 80%) तक बेसलाइन पर वापसी के 80% तक पहुंचने में लगने वाले समय का उपयोग किया गया था।
कुल मिलाकर सिकुड़न माप में आराम करने वाली बीटिंग आवृत्तियों, 20% पीक से पीक संकुचन (टीपी) तक का समय शामिल था। कॉन), और पीक संकुचन से बेसलाइन (टीबी) के 80% तक का समय। कॉन80) (चित्रा 1 बी)। एक तनाव के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, कोशिकाओं को आइसोप्रेनालाईन (आईएसओ) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इसके अलावा, संयोगवश संविदात्मकता माप के साथ, सीए 2+ क्षणिकों को250 हर्ट्ज की नमूना आवृत्ति पर फ्यूरा -2-एसिटोक्सीमिथाइल एस्टर (फुरा -2 एएम) के साथ कोशिकाओं को लोड करके मापा गया था। सीए 2 + माप डेटा को सीए2 + क्षणिक (TP.Ca) में 20% शिखर से शिखर तक के समय और बेसलाइन (TB.Ca 80) के शिखर से80% तक के समय के रूप में दर्शाया गया है (चित्रा 1 सी)। प्रत्येक क्षेत्र के लिए औसत सिकुड़ा हुआ और कैल्शियम गतिज पैरामीटर प्राप्त करने के लिए एक तेज, स्वचालित डेटा विश्लेषण उपकरण का उपयोग किया गया था।
इस अध्ययन में, एचआईपीएस-सीएम पर सिकुड़न और कैल्शियम क्षणिक माप करने और इन कोशिकाओं पर तनाव / दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। अनुबंध माप, अनुपातमीट्रिक कैल्शियम माप, और आईएसओ की प्रतिक्रिया जैविक प्रतिकृति के रूप में भेदभाव के तीन अलग-अलग दौर पर की गई थी। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए, तकनीकी प्रतिकृति के रूप में तीन कुओं पर माप किए गए थे। इस तरह से माप करने का कारण यह सुनिश्चित करना था कि जैविक परिवर्तनशीलता और नमूना और मंच की तकनीकी परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन किया जा सके। जैविक और तकनीकी प्रतिकृतियों की उचित संख्या पर विचार करने के अलावा, HIPSC-CM संवर्धन स्थिति निरंतर और मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। मानदंडों के अनुरूप होना महत्वपूर्ण है, जैसे कि एचआईपीएस-सीएम की उम्र, माध्यम की संरचना, रीप्लेटिंग की स्थिति और माप के दौरान यौगिक इनक्यूबेशन समय। इस अध्ययन में, एक कुएं में 10 सेकंड के लिए दो बार 11 क्षेत्रों को मापने के लिए औसतन 568 ± 24 सेकंड का समय लगा। इसमें 79 ± 11 सेकंड का आईएसओ इनक्यूबेशन समय शामिल है। यह लगभग 10 मिनट प्रति कुएं तक आता है, जो शोधकर्ताओं को ~ 4 घंटे में एक पूर्ण 24-वेल प्लेट को मापने में सक्षम होना चाहिए। जलवायु नियंत्रण का उपयोग स्थिर सीओ2 को बनाए रखने के लिए किया जाता है। यह हाई-स्पीड तरीके से HIPSC-CM पर यौगिकों / तनावों के प्रभाव को मापने की अनुमति देता है।
आईपीएससी-सीएम के सिकुड़ा हुआ कार्य को मापने के लिए, ऑप्टोजेनेटिक्स13 या लेबल-मुक्त वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी 5,6 पर निर्भर कई मौजूदा प्रणालियां हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स सिस्टम काफी जटिल हैं और इलेक्ट्रोफिज़िकल और / या कॉन्ट्रैक्टिलिटी डेटा प्राप्त करने के लिए विशेष तकनीकों की आवश्यकता होती है। अन्य सिस्टम वीडियो के पोस्ट-हॉक विश्लेषण पर भरोसा करते हैं, जिसके लिए बहुत अधिक भंडारण की आवश्यकता होती है और वीडियो अधिग्रहण के दौरान प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया का अभाव होता है। इसके अलावा, पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्राप्त करना कठिन है, जिसके परिणामस्वरूप अंडरसैंपलिंग हो सकती है। इसी तरह, सीआरआईएसपीआर / सीएएस -9-संपादित एचआईपीएस-सीएम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर7 के साथ कार्डियोमायोसाइट्स व्यवहार पर अवांछित प्रभाव पेश कर सकते हैं। संकुचन-विश्राम माप के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग एक सुरुचिपूर्ण दृष्टिकोण भी है, लेकिनलंबी अवधि में एक ही नमूने पर प्रयोग करने को सीमित करता है।
हालांकि, इस प्रकाशिकी-आधारित माप मंच का उपयोग किसी भी फ्लोरोसेंट डाई या आक्रामक तरीकों का उपयोग किए बिना संकुचन-विश्राम समय को मापने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि पिक्सेल सहसंबंध स्थानिक जानकारी प्रदान नहीं करता है, इसलिए इस विधि का उपयोग संकुचन की ताकत को मापने के लिए नहीं किया जा सकता है, बल्कि केवल संकुचन और विश्राम की गति में परिवर्तन का विश्वसनीय रूप से पता लगा सकता है। पेश की गई माप प्रणाली तापमान-नियंत्रित है और प्रति सेकंड >200 फ्रेम के रिज़ॉल्यूशन पर वास्तविक समय में कैल्शियम और अनुबंध डेटा प्राप्त कर सकती है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक माप का स्थान संग्रहीत किया जाता है, जो युग्मित माप को सक्षम करता है, जिससे प्रयोगों की शक्ति बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह मंच शोधकर्ताओं को डेटा स्टोर करने और प्रयोग के तुरंत बाद उनका विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है। कुल मिलाकर, यह प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली सेलुलर पैथोमैकेनिज्म का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक तरीका दिखाती है, एचआईपीएस-सीएम की कार्यक्षमता पर यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकती है, और दवा स्क्रीनिंग में प्रीक्लिनिकल प्रक्रिया के साथ सहायक हो सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को यूरोस्टार्स ग्रांट एस्टार्स 2 113937 कार्डियोमायो (ईएम एंड डीके), और एनडब्ल्यूओ-वीआईसीआई ग्रांट 91818602 (जेवी) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |