Ligadura do átrio esquerdo no embrião aviário como modelo de carga hemodinâmica alterada durante o desenvolvimento vascular inicial

Summary

Apresentamos aqui um protocolo visual detalhado para a execução do modelo de ligadura atrial esquerda (LAL) no embrião aviário. O modelo LAL altera o fluxo intracardíaco, o que altera a carga de tensão de cisalhamento da parede, mimetizando a síndrome da hipoplasia do coração esquerdo. Uma abordagem para superar os desafios deste difícil modelo de microcirurgia é apresentada.

Abstract

Devido à sua configuração ventricular madura de quatro câmaras, facilidade de cultivo, acesso à imagem e eficiência, o embrião aviário é um modelo animal vertebrado preferido para estudar o desenvolvimento cardiovascular. Estudos com o objetivo de compreender o desenvolvimento normal e o prognóstico das cardiopatias congênitas adotam amplamente esse modelo. Técnicas cirúrgicas microscópicas são introduzidas para alterar os padrões normais de carregamento mecânico em um ponto de tempo embrionário específico e rastrear a cascata molecular e genética a jusante. As intervenções mecânicas mais comuns são ligadura da veia vitelínea esquerda, bandagem conotruncal e ligadura atrial esquerda (LAE), modulando a pressão vascular intramural e o estresse de cisalhamento da parede devido ao fluxo sanguíneo. O LAL, particularmente se realizado em ovo, é a intervenção mais desafiadora, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas sequenciais extremamente finas. Apesar de seu alto risco, in ovoLAL é muito valioso cientificamente, pois mimetiza a patogênese da síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE). A SHCE é uma cardiopatia congênita complexa e clinicamente relevante observada em recém-nascidos humanos. Um protocolo detalhado para in ovo LAL está documentado neste artigo. Resumidamente, embriões de aves fertilizados foram incubados a 37,5 °C e 60% de umidade constante tipicamente até atingirem os estágios 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). As cascas dos ovos foram abertas e as membranas externa e interna foram removidas. O embrião foi rodado suavemente para expor o bulbo atrial esquerdo do átrio comum. Micronós pré-montados a partir de pontos de náilon 10-0 foram suavemente posicionados e amarrados ao redor do broto atrial esquerdo. Finalmente, o embrião foi devolvido à sua posição original, e LAL foi completado. Ventrículos normais e instrumentados em LAL demonstraram diferenças estatisticamente significativas na compactação tecidual. Um pipeline eficiente de geração de modelos LAL contribuiria para estudos com foco na manipulação mecânica e genética sincronizada durante o desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Da mesma forma, este modelo fornecerá uma fonte de células perturbadas para pesquisa em cultura de tecidos e biologia vascular.

Introduction

As cardiopatias congênitas (DCC) são distúrbios estruturais decorrentes do desenvolvimento embrionário anormal¹. Além das condições genéticas, a patogênese é influenciada pela carga mecânica alterada ^2,3. A síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE), uma cardiopatia congênita, resulta em ventrículo/aorta subdesenvolvidos ao nascimento⁴ com alta taxa de mortalidade ^5,6. Apesar dos recentes avanços em seu manejo clínico, a dinâmica de crescimento e desenvolvimento vascular da SHCE ainda não^{está clara7}. No desenvolvimento embrionário normal, o endocárdio e o miocárdio do ventrículo esquerdo (VE) originam-se de progenitores cardíacos à medida que a formação precoce do tubo cardíaco embrionário progride. É relatada a presença gradual de trabeculação miocárdica, espessamento das camadas e proliferação de cardiomiócitos². Para a SHCE, observa-se alteração do remodelamento trabecular e achatamento do ventrículo esquerdo, contribuindo ainda mais para a hipoplasia miocárdica devido^{à migração} anormal de cardiomiócitos2,8,9,10

Dentre os organismos-modelo amplamente utilizados para estudar o desenvolvimento cardíaco e compreender as condições hemodinâmicas 11, o embrião aviário é preferido devido ao seu coração maduro de quatro câmaras e à facilidade de cultivo^11,12,13,14. Por outro lado, o acesso avançado à imagem de embriões de peixe-zebra e camundongos transgênicos/knockout oferece vantagens distintas^11,12. Várias intervenções mecânicas têm sido testadas para o embrião aviário que alteram a pressão intramural e a tensão de cisalhamento da parede no desenvolvimento de componentes cardiovasculares. Esses modelos incluem ligadura vitelíntica esquerda, bandagem conotruncal15 e ligadura atrial esquerda (LAL)^11,12,16. O fenótipo resultante devido à carga mecânica alterada pode ser observado aproximadamente 24-48 h após a intervenção cirúrgica em estudos com foco no prognóstico precoce^11,13. A intervenção no LAL é uma técnica popular para estreitar o volume funcional do átrio esquerdo (AE) através da colocação de uma alça de sutura ao redor da abertura atrioventricular. Da mesma forma, intervenções microcirúrgicas também têm sido realizadas visando a ligadura atrial direita (RAL)^17,18. Da mesma forma, alguns pesquisadores têm como alvo o apêndice atrial esquerdo (AAE) utilizando microclipes para reduzir o volume do AE ^19,20. Em alguns estudos, um fio de náilon cirúrgico é aplicado no nó atrioventricular^19,21. Uma das intervenções utilizadas é o LAL, que pode mimetizar a SHCE, mas também é o modelo mais difícil de ser realizado, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas extremamente finas necessárias. Em nosso laboratório, o LBA é realizado em ovo entre os estágios 20 e 21 de Hamburger-Hamilton (HH), antes que o átrio comum esteja completamente septado6,14,22,23. Uma sutura cirúrgica é colocada ao redor do AL, o que altera as correntes sanguíneas intracardíacas. Nos modelos de LAL da SHCE, observa-se aumento da rigidez da parede do ventrículo, alteração dos ângulos das miofibras e diminuição do tamanho da cavidade do VE^14,24.

Neste artigo em vídeo, um protocolo detalhado e abordagem para in ovo LAL é fornecido. Resumidamente, os embriões de aves fertilizados foram incubados para microcirurgia, a casca do ovo foi rachada e as membranas externa e interna foram limpas. O embrião foi então girado lentamente para que o AE fosse acessível. Uma sutura cirúrgica com náilon 10-0 foi amarrada ao broto atrial e o embrião foi devolvido à sua orientação original, completando o procedimento LAL²⁵. LAL e ventrículos normais são comparados quanto à compactação do tecido e volume ventricular através de tomografia de coerência óptica e histologia básica.

Um pipeline de modelos LAL executado com sucesso, como descrito aqui, contribuirá para estudos básicos com foco no desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Este modelo também pode ser usado em conjunto com manipulações genéticas e modalidades avançadas de imagem. Da mesma forma, o modelo LAL agudo é uma fonte estável de células vasculares doentes para experimentos de cultura de tecidos.

Protocol

Os ovos brancos férteis de Leghorn são obtidos de fornecedores confiáveis e incubados de acordo com as diretrizes aprovadas pela universidade. Embriões de pintinhos, estágios 18 (dia 3) a 24 (dia 4) (os estágios apresentados neste artigo) não são considerados animais vertebrados vivos pela diretiva 2010/63/EU da União Europeia (UE) e pelas diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) nos EUA. Os embriões de pintinhos são considerados “animais vivos” após o 19º dia de incubação d…

Representative Results

Técnicas avançadas de imagem resolvidas no tempo podem ser empregadas para observar as alterações estruturais e morfológicas decorrentes da intervenção LAL10. Além disso, amostras de LAL também são passíveis de métodos moleculares e biológicos19,28. Na Tabela 1, são apresentados os estudos amostrais que utilizaram os resultados do modelo LAL. Nesse contexto, a intervenção LAL foi realizada em embriões de p…

Discussion

Na SHCE, o fluxo sanguíneo é alterado devido a defeitos estruturais, levando a morfologia anormal no lado esquerdo ^4,6. O presente modelo fornece um sistema experimental prático para melhor compreender a progressão da SHCE e pode até mimetizar sua patogênese8. No entanto, estabelecer um modelo animal de SHCE clinicamente equivalente é uma tarefa desafiadora. Além do modelo LAL aviário aqui apresentado, estudos recentes em camundon…

Materials

10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo