प्रारंभिक संवहनी विकास के दौरान परिवर्तित हेमोडायनामिक लोडिंग के लिए एक मॉडल के रूप में एवियन भ्रूण में बाएं एट्रियल लिगेशन
Summary
यहां, हम एवियन भ्रूण में बाएं एट्रियल लिगेशन (एलएएल) मॉडल को निष्पादित करने के लिए एक विस्तृत दृश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एलएएल मॉडल इंट्राकार्डियक प्रवाह को बदल देता है, जो दीवार कतरनी तनाव लोडिंग को बदलता है, हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम की नकल करता है। इस कठिन माइक्रोसर्जरी मॉडल की चुनौतियों को दूर करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
अपने चार-कक्षीय परिपक्व वेंट्रिकुलर विन्यास, संस्कृति में आसानी, इमेजिंग पहुंच और दक्षता के कारण, एवियन भ्रूण कार्डियोवैस्कुलर विकास का अध्ययन करने के लिए एक पसंदीदा कशेरुक पशु मॉडल है। सामान्य विकास और जन्मजात हृदय दोष रोग निदान को समझने के उद्देश्य से अध्ययन व्यापक रूप से इस मॉडल को अपनाते हैं। माइक्रोस्कोपिक सर्जिकल तकनीकों को एक विशिष्ट भ्रूण समय बिंदु पर सामान्य यांत्रिक लोडिंग पैटर्न को बदलने और डाउनस्ट्रीम आणविक और आनुवंशिक कैस्केड को ट्रैक करने के लिए पेश किया जाता है। सबसे आम यांत्रिक हस्तक्षेप बाएं विटेलिन नस बंधाव, कोनोट्रंकल बैंडिंग और बाएं एट्रियल लिगेशन (एलएएल) हैं, जो रक्त प्रवाह के कारण इंट्राम्यूरल संवहनी दबाव और दीवार कतरनी तनाव को संशोधित करते हैं। एलएएल, विशेष रूप से यदि ओवो में प्रदर्शन किया जाता है, तो सबसे चुनौतीपूर्ण हस्तक्षेप है, जिसमें बेहद ठीक अनुक्रमिक माइक्रोसर्जिकल ऑपरेशन के कारण बहुत कम नमूना पैदावार होती है। इसके उच्च जोखिम के बावजूद, ओवो एलएएल वैज्ञानिक रूप से बहुत मूल्यवान है क्योंकि यह हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम (एचएलएचएस) रोगजनन की नकल करता है। एचएलएचएस एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक, जटिल जन्मजात हृदय रोग है जो मानव नवजात शिशुओं में देखा जाता है। ओवो एलएएल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल इस पेपर में प्रलेखित है। संक्षेप में, निषेचित एवियन भ्रूण को 37.5 डिग्री सेल्सियस और 60% निरंतर आर्द्रता पर इनक्यूबेट किया गया था, जब तक कि वे हैमबर्गर-हैमिल्टन (एचएच) चरण 20 से 21 तक नहीं पहुंच जाते। अंडे के छिलके खुले हुए थे, और बाहरी और आंतरिक झिल्ली को हटा दिया गया था। सामान्य आलिंद के बाएं एट्रियल बल्ब को उजागर करने के लिए भ्रूण को धीरे से घुमाया गया था। 10-0 नायलॉन सीवन से पूर्व-इकट्ठे माइक्रो-नॉट्स को धीरे से रखा गया और बाएं एट्रियल कली के चारों ओर बांधा गया। अंत में, भ्रूण को उसकी मूल स्थिति में वापस कर दिया गया, और एलएएल पूरा हो गया। सामान्य और एलएएल-इंस्ट्रूमेंटेड वेंट्रिकल्स ने ऊतक संघनन में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया। एक कुशल एलएएल मॉडल पीढ़ी पाइपलाइन कार्डियोवैस्कुलर घटकों के भ्रूण के विकास के दौरान सिंक्रनाइज़ यांत्रिक और आनुवंशिक हेरफेर पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों में योगदान देगी। इसी तरह, यह मॉडल ऊतक संस्कृति अनुसंधान और संवहनी जीव विज्ञान के लिए एक परेशान सेल स्रोत प्रदान करेगा।
Introduction
जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) संरचनात्मक विकार हैं जो असामान्यभ्रूण के विकास के कारण होते हैं। आनुवंशिक स्थितियों के अलावा, रोगजनन परिवर्तित यांत्रिक लोडिंग 2,3 से प्रभावित होता है। हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम (एचएलएचएस), एक जन्मजात हृदय रोग, जन्मके समय एक अविकसित वेंट्रिकल / महाधमनी का परिणाम होता है जिसमें मृत्यु दर 5,6 होती है। इसके नैदानिक प्रबंधन में हालिया प्रगति के बावजूद, एचएलएचएस की संवहनी वृद्धि और विकास गतिशीलता अभीभी स्पष्ट नहीं है। सामान्य भ्रूण के विकास में, बाएं वेंट्रिकल (एलवी) एंडोकार्डियम और मायोकार्डियम हृदय पूर्वजों से उत्पन्न होते हैं क्योंकि प्रारंभिक भ्रूण हृदय ट्यूब गठन प्रगति करता है। मायोकार्डियल ट्रेबेक्यूलेशन, मोटी परतों और कार्डियोमायोसाइट्स प्रसार की क्रमिकउपस्थिति की सूचना दी गई है। एचएलएचएस के लिए, परिवर्तित ट्रेब्युलर रीमॉडेलिंग और बाएं वेंट्रिकुलर चपटेपन को देखा जाता है, जो असामान्य कार्डियोमायोसाइट्स माइग्रेशन 2,8,9,10 के कारण मायोकार्डियल हाइपोप्लासिया में योगदान देता है।
हृदय के विकास का अध्ययन करने और हेमोडायनामिक स्थितियों को समझने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीवों में से, एवियन भ्रूणको इसके चार-कक्षीय परिपक्व हृदय और11,12,13,14 की संस्कृति में आसानी के कारण पसंद किया जाता है। दूसरी ओर, जेब्राफिश भ्रूण और ट्रांसजेनिक / नॉकआउट चूहों की उन्नत इमेजिंग पहुंच अलग-अलग फायदे प्रदान करती है11,12. एवियन भ्रूण के लिए विभिन्न यांत्रिक हस्तक्षेपों का परीक्षण किया गया है जो कार्डियोवैस्कुलर घटकों को विकसित करने में इंट्राम्यूरल दबाव और दीवार कतरनी तनाव को बदलते हैं। इन मॉडलों में लेफ्ट विटेलिन लिगेशन, कोनोट्रंकल बैंडिंग15 और लेफ्ट एट्रियल लिगेशन (एलएएल) 11,12,16 शामिल हैं। परिवर्तित यांत्रिक लोडिंग के कारण परिणामी फेनोटाइप को प्रारंभिक पूर्वानुमान11,13 पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों में सर्जिकल हस्तक्षेप के लगभग 24-48 घंटे बाद देखा जा सकता है। एलएएल हस्तक्षेप एट्रियोवेंट्रिकुलर ओपनिंग के चारों ओर एक सीवन लूप रखकर बाएं आलिंद (एलए) की कार्यात्मक मात्रा को संकीर्ण करने के लिए एक लोकप्रिय तकनीक है। इसी तरह, माइक्रोसर्जिकल हस्तक्षेप भी किए गए हैं जो राइट एट्रियल लिगेशन (आरएएल) 17,18 को लक्षित करते हैं। इसी तरह, कुछ शोधकर्ता एलए19,20 की मात्रा को कम करने के लिए माइक्रो क्लिप का उपयोग करके बाएं एट्रियल उपांग (एलएए) को लक्षित करते हैं। कुछ अध्ययनों में, एक सर्जिकल नायलॉन धागा एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड19,21 पर लागू किया जाता है। उपयोग किए जाने वाले हस्तक्षेपों में से एक एलएएल है, जो एचएलएचएस की नकल कर सकता है, लेकिन प्रदर्शन करने के लिए सबसे कठिन मॉडल भी है, जिसमें बेहद ठीक माइक्रोसर्जिकल ऑपरेशन की आवश्यकता के कारण बहुत कम नमूना पैदावार होती है। हमारी प्रयोगशाला में, एलएएल को हैमबर्गर-हैमिल्टन (एचएच) चरण 20 और 21 के बीच ओवो में किया जाता है, इससे पहले कि आम आलिंद पूरी तरह से 6,14,22,23 हो। एलए के चारों ओर एक सर्जिकल सीवन रखा जाता है, जो इंट्राकार्डियक रक्त प्रवाह धाराओं को बदल देता है। एचएलएचएस के एलएएल मॉडल में, वेंट्रिकल दीवार कठोरता में वृद्धि, परिवर्तित मायोफिबर कोण, और एलवी गुहा आकार में कमी14,24 देखी गई है।
इस वीडियो लेख में, ओवो एलएएल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और दृष्टिकोण प्रदान किया गया है। संक्षेप में, निषेचित एवियन भ्रूण को माइक्रोसर्जरी के लिए इनक्यूबेट किया गया था, अंडे के छिलके को खुला छोड़ दिया गया था, और बाहरी और आंतरिक झिल्ली को साफ कर दिया गया था। भ्रूण को धीरे-धीरे घुमाया गया ताकि एलए सुलभ हो। एक 10-0 नायलॉन सर्जिकल सीवन को एट्रियल कली से बांधा गया था, और भ्रूण को एलएएल प्रक्रिया25 को पूरा करते हुए अपने मूल अभिविन्यास में वापस कर दिया गया था। एलएएल और सामान्य वेंट्रिकल्स की तुलना ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी और बुनियादी हिस्टोलॉजी के माध्यम से ऊतक संघनन और वेंट्रिकल वॉल्यूम के लिए की जाती है।
एक सफलतापूर्वक निष्पादित एलएएल मॉडल पाइपलाइन, जैसा कि यहां वर्णित है, कार्डियोवैस्कुलर घटकों के भ्रूण के विकास पर ध्यान केंद्रित करने वाले बुनियादी अध्ययनों में योगदान देगा। इस मॉडल का उपयोग आनुवंशिक जोड़तोड़ और उन्नत इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ भी किया जा सकता है। इसी तरह, तीव्र एलएएल मॉडल ऊतक संवर्धन प्रयोगों के लिए रोगग्रस्त संवहनी कोशिकाओं का एक स्थिर स्रोत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचएलएचएस में, संरचनात्मक दोषों के कारण रक्त प्रवाह बदल जाता है, जिससे बाईं ओर असामान्य आकृति विज्ञान 4,6 हो जाता है। वर्तमान मॉडल एचएलएचएस की प्रगति को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम धन प्रदान करने वाले तुबीटक 2247 ए प्रमुख शोधकर्ता पुरस्कार 120 सी 139 को स्वीकार करते हैं। लेखक पाकतावुक गिडा को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। ए.एस., इस्तांबुल, तुर्की, उपजाऊ अंडे प्रदान करने और कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान का समर्थन करने के लिए।
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
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