鳥類胚における左心房結紮術は、血管発生初期における血行動態負荷の変化のモデルとして
Summary
ここでは、鳥類の胚で左心房結紮(LAL)モデルを実行するための詳細なビジュアルプロトコルを紹介します。LALモデルは、心臓内の流れを変化させ、壁のせん断応力負荷を変化させ、左心低形成症候群を模倣します。この困難なマイクロサージェリーモデルの課題を克服するためのアプローチが提示されます。
Abstract
鳥類の胚は、その4室の成熟した心室構成、培養の容易さ、画像アクセス、および効率性により、心血管の発達を研究するための脊椎動物モデルとして好まれています。正常な発達と先天性心疾患の予後を理解することを目的とした研究では、このモデルが広く採用されています。顕微鏡手術技術を導入して、特定の胚の時点で通常の機械的負荷パターンを変更し、下流の分子および遺伝子カスケードを追跡します。最も一般的な機械的介入は、左硝子体静脈結紮術、コノトランカルバンディング、および左心房結紮術(LAL)であり、血流による壁内血管圧と壁面せん断応力を調節します。LALは、特に ovoで実施された場合、最も困難な介入であり、非常に細かい逐次顕微鏡手術のために非常に小さなサンプル収量があります。その高いリスクにもかかわらず、 卵子では 、低形成性左心症候群(HLHS)の病因を模倣するため、科学的に非常に価値があります。HLHSは、ヒトの新生児に見られる臨床的に関連性のある複雑な先天性心疾患です。 in ovo LALの詳細なプロトコルは、この論文に記載されています。簡単に説明すると、受精した鳥類の胚は、通常、ハンバーガー・ハミルトン(HH)ステージ20〜21に達するまで、37.5°C、60%の一定湿度でインキュベートされました。卵の殻を割って開き、外膜と内膜を取り除きました。胚を緩やかに回転させて、総心房の左心房球を露出させた。10-0ナイロン縫合糸から事前に組み立てられたマイクロノットを静かに配置し、左心房芽の周りに結びました。最後に、胚を元の位置に戻して、LALが完成しました。正常心室とLALで計装された心室は、組織の圧縮に統計学的に有意な差を示しました。効率的なLALモデル生成パイプラインは、心血管コンポーネントの胚発生中の同期した機械的および遺伝的操作に焦点を当てた研究に貢献します。同様に、このモデルは、組織培養研究と血管生物学のための摂動細胞源を提供します。
Introduction
先天性心疾患(CHD)は、胚発生の異常によって起こる構造的疾患です1。遺伝的状態に加えて、病因は機械的負荷の変化の影響を受けます2,3。先天性心疾患である左心低形成症候群(HLHS)は、出生時に心室/大動脈が未発達になり4、死亡率が高い5,6。その臨床管理の最近の進歩にもかかわらず、HLHSの血管の成長と発達のダイナミクスはまだ不明です7。正常な胚発生では、左心室(LV)心内膜および心筋は、初期胚性心臓管形成が進行するにつれて心臓前駆細胞に由来する。心筋線維柱帯、肥厚層、および心筋細胞増殖の段階的な存在が報告されています2。HLHSでは、線維柱帯リモデリングの変化と左心室の平坦化が観察され、異常な心筋細胞の移動による心筋形成不全にさらに寄与します2,8,9,10
心臓の発達を研究し、血行動態を理解するために広く使用されているモデル生物11の中で、鳥類の胚は、その4室の成熟した心臓と培養の容易さのために好まれています11,12,13,14。一方、ゼブラフィッシュの胚とトランスジェニック/ノックアウトマウスの高度なイメージングアクセスには、明確な利点があります11,12。鳥類の胚に対して、心血管成分の発達における壁内圧と壁せん断応力を変化させるさまざまな機械的介入がテストされています。これらのモデルには、左硝子体結紮術、コノトランカルバンディング15、および左心房結紮術(LAL)11,12,16が含まれます。機械的負荷の変化による結果の表現型は、早期予後に焦点を当てた研究における外科的介入の約24〜48時間後に観察できます11,13。LAL介入は、房室開口部の周囲に縫合糸ループを配置することにより、左心房(LA)の機能容積を狭める一般的な技術です。同様に、右心房結紮術(RAL)を標的とする顕微外科的介入も行われている17,18。同様に、一部の研究者は、LA19,20の体積を減らすために、マイクロクリップを使用して左心耳(LAA)を標的としています。いくつかの研究では、外科用ナイロン糸が房室リンパ節19,21に適用される。使用される介入の 1 つは LAL で、HLHS を模倣できますが、非常に細かい顕微鏡手術が必要なため、サンプル収量が非常に少ないため、実行が最も難しいモデルでもあります。私たちの研究室では、LALはハンバーガーハミルトン(HH)ステージ20と21の間の卵子で行われ、総心房が完全に中隔6,14,22,23になる前です。LAの周囲に外科的縫合糸を配置し、心臓内血流を変化させます。HLHSのLALモデルでは、心室壁の剛性の増加、筋線維の角度の変化、およびLV腔サイズの減少が観察されます14,24。
このビデオ記事では、 in ovo LALの詳細なプロトコルとアプローチが提供されています。簡単に言うと、受精した鳥類の胚を顕微鏡手術のためにインキュベートし、卵殻を割って開き、外膜と内膜をきれいにしました。その後、胚をゆっくりと回転させて、LAにアクセスできるようにしました。10-0ナイロン製の外科的縫合糸を心房芽に結び付け、胚を元の向きに戻して、LAL手順25を完了しました。LALと正常心室は、光干渉断層撮影法と基本的な組織学 を介して 、組織の圧縮と心室容積について比較されます。
本稿で説明したように、LALモデルパイプラインの運用に成功すれば、心血管系成分の胚発生に焦点を当てた基礎研究に貢献することが期待されます。このモデルは、遺伝子操作や高度なイメージングモダリティと組み合わせて使用することもできます。同様に、急性LALモデルは、組織培養実験のための病変血管細胞の安定した供給源です。
Protocol
Representative Results
Discussion
HLHSでは、構造的欠陥により血流が変化し、左側に異常な形態が生じます4,6。本モデルは、HLHSの進行をよりよく理解するための実用的な実験システムを提供し、その病因を模倣することさえできるかもしれません8。しかし、完全に臨床的に同等のHLHS動物モデルを確立することは困難な作業です。ここで紹介した鳥類のLALモデルに?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tubitak 2247A主任研究者賞120C139に資金提供をいただいたことに感謝いたします。また、PakTavuk Gıda氏にも感謝の意を表します。A. S., Istanbul, Turkey, 受精卵の提供と心臓血管研究の支援
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
