Vänster förmaksligering i fågelembryot som modell för förändrad hemodynamisk belastning under tidig vaskulär utveckling
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat visuellt protokoll för att utföra modellen för vänster förmaksligering (LAL) i fågelembryot. LAL-modellen förändrar det intrakardiella flödet, vilket förändrar väggskjuvspänningsbelastningen, vilket efterliknar hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom. Ett tillvägagångssätt för att övervinna utmaningarna med denna svåra mikrokirurgiska modell presenteras.
Abstract
På grund av dess fyrkammarformade mogna ventrikulära konfiguration, enkla odling, avbildningsåtkomst och effektivitet är fågelembryot en föredragen ryggradsdjurmodell för att studera kardiovaskulär utveckling. Studier som syftar till att förstå den normala utvecklingen och prognosen för medfödda hjärtfel använder i stor utsträckning denna modell. Mikroskopiska kirurgiska tekniker introduceras för att ändra de normala mekaniska belastningsmönstren vid en specifik embryonal tidpunkt och spåra den molekylära och genetiska kaskaden nedströms. De vanligaste mekaniska ingreppen är vänster vitellinvenligering, conotruncal banding och vänster förmaksligering (LAL), som modulerar det intramurala kärltrycket och väggskjuvspänningen på grund av blodflödet. LAL, särskilt om det utförs i ovo, är det mest utmanande ingreppet, med mycket små provutbyten på grund av de extremt fina sekventiella mikrokirurgiska operationerna. Trots sin höga risk är LAL i ovo mycket värdefullt vetenskapligt eftersom det efterliknar hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) patogenes. HLHS är en kliniskt relevant, komplex medfödd hjärtsjukdom som observeras hos nyfödda människor. Ett detaljerat protokoll för in ovo LAL dokumenteras i detta dokument. I korthet inkuberades befruktade fågelembryon vid 37,5 °C och 60 % konstant luftfuktighet tills de nådde Hamburger-Hamilton (HH) stadierna 20 till 21. Äggskalen sprack upp och de yttre och inre hinnorna togs bort. Embryot roterades försiktigt för att exponera den vänstra förmaksbulben i det gemensamma förmaket. Förmonterade mikroknutar från 10-0 nylonsuturer placerades försiktigt och knöts runt den vänstra förmaksknoppen. Slutligen återställdes embryot till sin ursprungliga position och LAL fullbordades. Normala och LAL-instrumenterade ventriklar visade statistiskt signifikanta skillnader i vävnadspackning. En effektiv LAL-modellgenereringspipeline skulle bidra till studier som fokuserar på synkroniserad mekanisk och genetisk manipulation under den embryonala utvecklingen av kardiovaskulära komponenter. På samma sätt kommer denna modell att utgöra en störd cellkälla för vävnadsodlingsforskning och vaskulär biologi.
Introduction
Medfödda hjärtfel är strukturella störningar som uppstår på grund av onormal embryonal utveckling1. Förutom genetiska förhållanden påverkas patogenesen av förändrad mekanisk belastning 2,3. Hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS), en medfödd hjärtsjukdom, resulterar i en underutvecklad kammare/aorta vid födseln4 med hög dödlighet 5,6. Trots de senaste framstegen i den kliniska hanteringen är den vaskulära tillväxt- och utvecklingsdynamiken för HLHS fortfarande oklar7. Vid normal embryonal utveckling härstammar endokardiet och hjärtmuskeln i vänster kammare (LV) från hjärtats stamceller när den tidiga embryonala hjärtrörsbildningen fortskrider. Den gradvisa förekomsten av myokardtrabekulation, förtjockningsskikt och kardiomyocytproliferation har rapporterats2. För HLHS observeras förändrad trabekulär remodellering och vänsterkammartillplattning, vilket ytterligare bidrar till myokardhypoplasi på grund av onormal kardiomyocytmigration 2,8,9,10
Bland de allmänt använda modellorganismerna för att studera hjärtats utveckling och förstå hemodynamiska förhållanden 11 är fågelembryot att föredra på grund av dess mogna hjärta med fyra kammare och dess lätthet att odla11,12,13,14. Å andra sidan ger avancerad avbildningsåtkomst av zebrafiskembryon och transgena/knockout-möss tydliga fördelar11,12. Olika mekaniska ingrepp har testats för fågelembryot som förändrar det intramurala trycket och väggskjuvspänningen vid utveckling av kardiovaskulära komponenter. Dessa modeller inkluderar vänster vitellinligering, conotruncal banding15 och vänster förmaksligering (LAL)11,12,16. Den resulterande fenotypen på grund av den förändrade mekaniska belastningen kan observeras cirka 24-48 timmar efter det kirurgiska ingreppet i studier med fokus på tidig prognos11,13. LAL-interventionen är en populär teknik för att minska den funktionella volymen i vänster förmak (LA) genom att placera en suturslinga runt den atrioventrikulära öppningen. På samma sätt har mikrokirurgiska ingrepp också utförts som riktar sig mot höger förmaksligering (RAL)17,18. På samma sätt riktar vissa forskare in sig på det vänstra förmaksbihanget (LAA) med hjälp av mikroklipp för att minska volymen på LA19,20. I vissa studier appliceras en kirurgisk nylontråd på den atrioventrikulära knutan19,21. En av de interventioner som används är LAL, som kan efterlikna HLHS men som också är den svåraste modellen att utföra, med mycket små provutbyten på grund av de extremt fina mikrokirurgiska operationer som krävs. I vårt laboratorium utförs LAL i ovo mellan Hamburger-Hamilton (HH) steg 20 och 21, innan det gemensamma förmaket är helt septat 6,14,22,23. En kirurgisk sutur placeras runt LA, vilket förändrar blodflödet i hjärtat. I LAL-modeller av HLHS observeras ökad ventrikelväggsstyvhet, förändrade myofibervinklar och minskad LV-kavitetsstorlek14,24.
I den här videoartikeln finns ett detaljerat protokoll och tillvägagångssätt för in ovo LAL. I korthet inkuberades de befruktade fågelembryona för mikrokirurgi, äggskalet sprack upp och de yttre och inre membranen rensades. Embryot roterades sedan långsamt så att LA var tillgängligt. En 10-0 nylon kirurgisk sutur knöts till förmaksknoppen, och embryot återställdes till sin ursprungliga orientering, vilket fullbordade LAL-proceduren25. LAL och normala ventriklar jämförs för vävnadspackning och kammarvolym via optisk koherenstomografi och grundläggande histologi.
En framgångsrikt genomförd LAL-modellpipeline, som beskrivs här, kommer att bidra till grundläggande studier med fokus på embryonal utveckling av kardiovaskulära komponenter. Denna modell kan också användas tillsammans med genetiska manipulationer och avancerade avbildningsmodaliteter. På samma sätt är den akuta LAL-modellen en stabil källa till sjuka kärlceller för vävnadsodlingsexperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vid HLHS förändras blodflödet på grund av strukturella defekter, vilket leder till onormal morfologi på vänster sida 4,6. Den nuvarande modellen ger ett praktiskt experimentellt system för att bättre förstå utvecklingen av HLHS och kan till och med efterlikna dess patogenes8. Att etablera en fullt kliniskt likvärdig HLHS-djurmodell är dock en utmanande uppgift. Förutom den aviära LAL-modellen som presenteras här har nya stud…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppmärksammar Tubitak 2247A lead researcher award 120C139 som tillhandahåller finansiering. Författarna vill också tacka PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Turkiet, för tillhandahållande av fertila ägg och stöd till kardiovaskulär forskning.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
