بروتوكول فحص القص لتحديد خصائص المواد أحادية الخلية
Summary
يحدد هذا البروتوكول القياس الكمي للخصائص الميكانيكية لخطوط الخلايا السرطانية وغير السرطانية في المختبر. يمكن أن تعمل الاختلافات المحفوظة في ميكانيكا الخلايا السرطانية والطبيعية كعلامة حيوية قد يكون لها آثار في التشخيص والتشخيص.
Abstract
الميكانيكا الحيوية غير المنتظمة هي السمة المميزة لبيولوجيا السرطان الخاضعة لدراسة مستفيضة. الخواص الميكانيكية للخلية مماثلة لتلك الخاصة بالمادة. مقاومة الخلية للإجهاد والإجهاد ، ووقت استرخاءها ، ومرونتها كلها خصائص يمكن اشتقاقها ومقارنتها بأنواع أخرى من الخلايا. يسمح تحديد الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية (الخبيثة) مقابل الخلايا الطبيعية (غير الخبيثة) للباحثين بالكشف عن الأساسيات الفيزيائية الحيوية لهذا المرض. في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف باستمرار عن الخواص الميكانيكية للخلايا الطبيعية ، إلا أنه لا يوجد إجراء تجريبي قياسي لاستنتاج هذه الخصائص من الخلايا في الثقافة.
تحدد هذه الورقة إجراء لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة في المختبر باستخدام مقايسة قص السوائل. يتضمن المبدأ الكامن وراء هذا الفحص تطبيق إجهاد قص السوائل على خلية واحدة ومراقبة التشوه الخلوي الناتج بصريا بمرور الوقت. يتم بعد ذلك توصيف الخواص الميكانيكية للخلية باستخدام تحليل ارتباط الصورة الرقمية (DIC) وتركيب نموذج لزج مرن مناسب للبيانات التجريبية الناتجة عن تحليل DIC. بشكل عام ، يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى توفير طريقة أكثر فعالية واستهدافا لتشخيص السرطانات التي يصعب علاجها.
Introduction
تتيح دراسة الاختلافات الفيزيائية الحيوية بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية فرصا تشخيصية وعلاجية جديدة1. إن فهم كيفية مساهمة الاختلافات في الميكانيكا الحيوية / علم الأحياء الميكانيكي في تطور الورم ومقاومة العلاج سيكشف عن طرق جديدة للعلاج الموجه والتشخيص المبكر2.
في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف عن الخلايا الطبيعية (على سبيل المثال ، مرونة اللزوجة في غشاء البلازما والغلاف النووي)3،4،5 ، إلا أن الطرق القوية والقابلة للتكرار لقياس هذه الخصائص في الخلايا الحية غير موجودة6. تستخدم طريقة مقايسة القص لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا عن طريق إخضاع الخلايا المفردة لإجهاد القص السائل وتحليل استجاباتها الفردية ومقاومتها للإجهاد المطبق3،4،5،7،8،9. على الرغم من استخدام العديد من الطرق والتقنيات لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة ، إلا أنها تميل إلى التأثير على خصائص مادة الخلية عن طريق i) تثقيب / إتلاف غشاء الخلية بسبب عمق المسافة البادئة ، أو هندسة الطرف المعقدة ، أو تصلب الركيزة المرتبط بمجهر القوة الذرية (AFM) 10،11 ، ii) إحداث تلف ضوئي خلوي أثناء الاصطياد البصري12 ، 13 ، أو iii) إحداث حالات إجهاد معقدة مرتبطة بشفط الماصةالدقيقة 14,15. ترتبط هذه التأثيرات الخارجية بشكوك كبيرة في دقة قياسات مرونة لزوجة الخلية6،16،17.
لمعالجة هذه القيود ، توفر طريقة فحص القص الموصوفة هنا نهجا بسيطا ويمكن التحكم فيه بدرجة كبيرة لمحاكاة التدفق الفسيولوجي في الجسم دون التأثير على خصائص المواد الخلوية في العملية. تمثل إجهادات قص السوائل في هذا الفحص ضغوطا ميكانيكية تعاني منها الخلايا في الجسم إما عن طريق السوائل داخل الخلالي للورم أو في الدم أثناء الدورة الدموية18،19،20. علاوة على ذلك ، تعزز ضغوط السوائل هذه السلوكيات الخبيثة المختلفة في الخلايا السرطانية ، بما في ذلك التقدم والهجرة وورم خبيث وموت الخلايا19،21،22،23 والتي تختلف بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية. علاوة على ذلك ، فإن السمات الميكانيكية المتغيرة للخلايا السرطانية (أي أنها غالبا ما تكون “أكثر ليونة” من الخلايا الطبيعية الموجودة داخل نفس العضو) تسمح لها بالاستمرار في البيئات الدقيقة المعادية للورم ، وغزو الأنسجة الطبيعية المحيطة ، والانتقال إلى مواقع بعيدة24،25،26. من خلال خلق بيئة بيولوجية زائفة حيث تعاني الخلايا من مستويات فسيولوجية من إجهاد قص السوائل ، يتم تحقيق عملية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وليست مدمرة للخلية. تسمح لنا الاستجابات الخلوية لضغوط قص السوائل المطبقة هذه بتوصيف الخواص الميكانيكية للخلية.
يقدم هذا البحث بروتوكول مقايسة القص للدراسة المكثفة للخصائص الميكانيكية وسلوك الخلايا السرطانية وغير السرطانية تحت إجهاد القص المطبق. تستجيب الخلايا للقوى الخارجية بطريقة مرنة ولزجة وبالتالي يمكن أن تكون مثالية كمادة لزجةمرنة 3. يتم تصنيف هذه التقنية إلى: (i) زراعة الخلايا للخلايا المفردة المشتتة ، (ii) التطبيق المتحكم فيه لإجهاد قص السوائل ، (iii) التصوير في الموقع ومراقبة السلوك الخلوي (بما في ذلك مقاومة الإجهاد والتشوه) ، (iv) تحليل سلالة الخلايا لتحديد مدى التشوه ، و (v) توصيف الخصائص اللزجة المرنة للخلايا المفردة. من خلال استجواب هذه الخصائص والسلوكيات الميكانيكية ، يمكن تقطير البيولوجيا الميكانيكية الخلوية المعقدة إلى بيانات قابلة للقياس الكمي. يسمح البروتوكول الذي يحدد هذه الطريقة بفهرسة ومقارنة أنواع الخلايا الخبيثة وغير الخبيثة المختلفة. إن القياس الكمي لهذه الاختلافات لديه القدرة على إنشاء مؤشرات حيوية تشخيصية وعلاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنتجت طريقة فحص القص ، والتي تتضمن إنشاء بيئة ميكانيكية بيولوجية زائفة لمحاكاة تفاعل الخلايا مع البيئة الدقيقة الميكانيكية المحيطة واستجاباتها للضغوط الميكانيكية ، كتالوجا للخصائص الميكانيكية الخلوية ، التي تظهر أنماطها اللانمطية الفيزيائية المحفوظة بين خطوط الخلايا السرطانية<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الباحثين السابقين من مجموعة Soboyejo في معهد Worcester Polytechnic الذين كانوا رائدين في هذه التقنية لأول مرة: Drs. Yifang Cao و Jingjie Hu و Vanessa Uzonwanne. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (NIH / NCI K22 CA258410 إلى MD.). تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
