Shear Assay Protocol voor de bepaling van eencellige materiaaleigenschappen
Summary
Dit protocol schetst de kwantificering van de mechanische eigenschappen van kankerachtige en niet-kankerachtige cellijnen in vitro. Geconserveerde verschillen in de mechanica van kankercellen en normale cellen kunnen fungeren als een biomarker die implicaties kan hebben voor de prognose en diagnose.
Abstract
Onregelmatige biomechanica is een kenmerk van kankerbiologie die uitgebreid wordt bestudeerd. De mechanische eigenschappen van een cel zijn vergelijkbaar met die van een materiaal. De weerstand van een cel tegen stress en spanning, de ontspanningstijd en de elasticiteit zijn allemaal eigenschappen die kunnen worden afgeleid en vergeleken met andere soorten cellen. Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van kankerachtige (kwaadaardige) versus normale (niet-kwaadaardige) cellen stelt onderzoekers in staat om de biofysische fundamenten van deze ziekte verder te ontdekken. Hoewel bekend is dat de mechanische eigenschappen van kankercellen consequent verschillen van de mechanische eigenschappen van normale cellen, ontbreekt een standaard experimentele procedure om deze eigenschappen af te leiden van cellen in cultuur.
Dit artikel schetst een procedure om de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen in vitro te kwantificeren met behulp van een vloeistofschuiftest. Het principe achter deze test omvat het toepassen van vloeistofschuifspanning op een enkele cel en het optisch monitoren van de resulterende cellulaire vervorming in de loop van de tijd. Celmechanische eigenschappen worden vervolgens gekarakteriseerd met behulp van digitale beeldcorrelatie (DIC) -analyse en het aanpassen van een geschikt visco-elastisch model aan de experimentele gegevens die uit de DIC-analyse worden gegenereerd. Over het algemeen is het hier beschreven protocol gericht op het bieden van een effectievere en gerichtere methode voor de diagnose van moeilijk te behandelen kankers.
Introduction
Het bestuderen van de biofysische verschillen tussen kankercellen en niet-kankercellen biedt nieuwe diagnostische en therapeutische mogelijkheden1. Inzicht in hoe verschillen in biomechanica / mechanobiologie bijdragen aan tumorprogressie en behandelingsresistentie zal nieuwe wegen onthullen voor gerichte therapie en vroege diagnose2.
Hoewel bekend is dat de mechanische eigenschappen van kankercellen verschillen van normale cellen (bijv. Visco-elasticiteit van het plasmamembraan en de nucleaire envelop)3,4,5, ontbreken robuuste en reproduceerbare methoden voor het meten van deze eigenschappen in levende cellen 6. De shear assay-methode wordt gebruikt om de mechanische eigenschappen van cellen te kwantificeren door afzonderlijke cellen te onderwerpen aan vloeistofschuifspanning en hun individuele reacties en weerstand tegen de toegepaste spanningte analyseren 3,4,5,7,8,9. Hoewel verschillende methoden en technieken zijn gebruikt om de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen te karakteriseren, hebben deze de neiging om de eigenschappen van het celmateriaal te beïnvloeden door i) het celmembraan te perforeren / beschadigen als gevolg van de inkepingsdiepte, complexe tipgeometrieën of substraatverstijving geassocieerd met atoomkrachtmicroscopie (AFM) 10,11, ii) het induceren van cellulaire fotoschade tijdens optische overvulling 12, 13, of iii) het induceren van complexe stresstoestanden geassocieerd met micropipetaspiratie14,15. Deze externe effecten gaan gepaard met aanzienlijke onzekerheden in de nauwkeurigheid van celvisco-elasticiteitsmetingen 6,16,17.
Om deze beperkingen aan te pakken, biedt de hier beschreven afschuiftestmethode een zeer controleerbare en eenvoudige benadering om de fysiologische stroming in het lichaam te simuleren zonder de eigenschappen van cellulair materiaal in het proces te beïnvloeden. Vloeistofschuifspanningen in deze test vertegenwoordigen mechanische spanningen die door cellen in het lichaam worden ervaren, hetzij door vloeistoffen in het tumorinterstitium of in het bloed tijdens circulatie18,19,20. Verder bevorderen deze vloeistofspanningen verschillende kwaadaardige gedragingen in kankercellen, waaronder progressie, migratie, metastase en celdood 19,21,22,23 die variëren tussen tumorogene en niet-tumorigene cellen. Bovendien stellen de veranderde mechanische kenmerken van kankercellen (d.w.z. ze zijn vaak “zachter” dan normale cellen in hetzelfde orgaan) hen in staat om te blijven bestaan in vijandige tumormicro-omgevingen, omliggende normale weefsels binnen te dringen en uit te zaaien naar verre locaties24,25,26. Door een pseudo-biologische omgeving te creëren waar cellen fysiologische niveaus van vloeistofschuifspanning ervaren, wordt een proces bereikt dat fysiologisch relevant is en niet destructief voor de cel. De cellulaire reacties op deze toegepaste vloeistofschuifspanningen stellen ons in staat om celmechanische eigenschappen te karakteriseren.
Dit artikel biedt een afschuiftestprotocol voor de uitgebreide studie van de mechanische eigenschappen en het gedrag van kankercellen en niet-kankercellen onder toegepaste schuifspanning. Cellen reageren op externe krachten op een elastische en stroperige manier en kunnen daarom worden geïdealiseerd als een visco-elastisch materiaal3. Deze techniek is onderverdeeld in: (i) celcultuur van gedispergeerde afzonderlijke cellen, (ii) gecontroleerde toepassing van vloeistofschuifspanning, (iii) in situ beeldvorming en observatie van cellulair gedrag (inclusief weerstand tegen stress en vervorming), (iv) spanningsanalyse van cellen om de mate van vervorming te bepalen, en (v) karakterisering van de visco-elastische eigenschappen van afzonderlijke cellen. Door deze mechanische eigenschappen en gedragingen te onderzoeken, kan complexe cellulaire mechanobiologie worden gedestilleerd tot kwantificeerbare gegevens. Een protocol dat deze methode beschrijft, maakt het mogelijk om verschillende kwaadaardige en niet-kwaadaardige celtypen te catalogiseren en te vergelijken. Het kwantificeren van deze verschillen heeft het potentieel om diagnostische en therapeutische biomarkers vast te stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De shear assay-methode, die het opzetten van een pseudo-mechanobiologische omgeving omvat om de interactie van cellen met de omringende mechanische micro-omgeving en hun reacties op mechanische spanningen te simuleren, heeft een catalogus van cellulaire mechanische eigenschappen geproduceerd, waarvan de patronen geconserveerde fysieke atypie tonen onder kankerachtige cellijnen 3,4,5,7,8 </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken eerdere onderzoekers van de Soboyejo-groep aan het Worcester Polytechnic Institute die voor het eerst pionierden met deze techniek: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu en Vanessa Uzonwanne. Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 tot MD). Figuren werden gemaakt met BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
