단세포 물질 특성 측정을 위한 전단 분석 프로토콜
Summary
이 프로토콜은 시험관 내에서 암성 및 비암성 세포주의 기계적 특성의 정량화를 설명합니다. 암세포와 정상 세포의 역학에서 보존된 차이는 예후와 진단에 영향을 미칠 수 있는 바이오마커로 작용할 수 있습니다.
Abstract
불규칙한 생체 역학은 광범위한 연구 대상인 암 생물학의 특징입니다. 셀의 기계적 특성은 재료의 기계적 특성과 유사합니다. 스트레스와 긴장에 대한 세포의 저항력, 이완 시간 및 탄력성은 모두 다른 유형의 세포와 비교하고 도출할 수 있는 특성입니다. 암성(악성) 세포와 정상(비악성) 세포의 기계적 특성을 정량화함으로써 연구자들은 이 질병의 생물물리학적 기초를 추가로 밝힐 수 있습니다. 암세포의 기계적 특성은 정상 세포의 기계적 특성과 일관되게 다른 것으로 알려져 있지만, 배양 중인 세포로부터 이러한 특성을 추론하는 표준 실험 절차는 부족합니다.
이 논문은 유체 전단 분석을 사용하여 시험관 내에서 단일 세포의 기계적 특성을 정량화하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 분석의 원리는 단일 세포에 유체 전단 응력을 적용하고 시간 경과에 따른 세포 변형을 광학적으로 모니터링하는 것입니다. 세포 기계적 특성은 디지털 이미지 상관 관계 (DIC) 분석을 사용하고 DIC 분석에서 생성 된 실험 데이터에 적절한 점탄성 모델을 맞추는 데 사용됩니다. 전반적으로, 여기에 요약된 프로토콜은 치료하기 어려운 암의 진단을 위한 보다 효과적이고 표적화된 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.
Introduction
암성 세포와 비암성 세포 간의 생물물리학적 차이를 연구하면 새로운 진단 및 치료 기회를 얻을 수 있습니다1. 생체역학/기계생물학의 차이가 종양 진행 및 치료 저항성에 어떻게 기여하는지 이해하면 표적 치료 및 조기 진단을 위한 새로운 길을 제시할 수 있습니다2.
암세포의 기계적 성질이 정상 세포와 다르다는 것은 알려져 있지만(예를 들어, 원형질막과 핵막의 점탄성)3,4,5, 살아있는 세포에서 이러한 성질을 측정하기 위한 견고하고 재현 가능한 방법은 부족하다6. 전단 분석 방법은 단일 세포에 유체 전단 응력을 가하고 적용된 응력 3,4,5,7,8,9에 대한 개별 반응 및 저항을 분석하여 세포의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용됩니다. 단일 세포의 기계적 특성을 특성화하기 위해 여러 방법 및 기술이 사용되었지만, 이들은 i) 원자력 현미경(AFM)과 관련된 압흔 깊이, 복잡한 팁 형상 또는 기판 경화로 인한 세포막을 천공/손상시킴으로써 세포 재료 특성에 영향을 미치는 경향이 있습니다.10,11, ii) 광학 트래핑(12) 동안 세포 광손상을 유도하고, 13, 또는 iii) 마이크로피펫 흡인과 관련된 복잡한 스트레스 상태 유도14,15. 이러한 외부 효과는 세포 점탄성 측정 6,16,17의 정확도에 상당한 불확실성과 관련이 있습니다.
이러한 한계를 해결하기 위해 여기에 설명된 전단 분석 방법은 공정에서 세포 물질 특성에 영향을 주지 않고 신체의 생리학적 흐름을 시뮬레이션할 수 있는 고도로 제어 가능하고 간단한 접근 방식을 제공합니다. 이 분석에서 유체 전단 응력은 순환 동안 종양 간질 내 또는 혈액 내의 체액에 의해 신체의 세포가 경험하는 기계적 응력을 나타냅니다18,19,20. 또한, 이러한 체액 스트레스는 종양 형성 세포와 비종양 형성 세포 사이에서 변하는 진행, 이동, 전이 및 세포 사멸을 포함하여 암세포에서 다양한 악성 행동을 촉진합니다 19,21,22,23. 더욱이, 암세포의 변형된 기계적 특징(즉, 암세포는 종종 동일한 기관 내에서 발견되는 정상 세포보다 “부드럽다”)은 암세포가 적대적인 종양 미세 환경에서 지속되고, 주변 정상 조직을 침범하고, 먼 부위로 전이될 수 있도록 한다24,25,26. 세포가 생리학적 수준의 유체 전단 응력을 경험하는 유사 생물학적 환경을 생성함으로써 생리학적으로 관련이 있고 세포를 파괴하지 않는 과정이 달성됩니다. 이러한 적용된 유체 전단 응력에 대한 세포 반응을 통해 세포의 기계적 특성을 특성화할 수 있습니다.
이 논문은 적용된 전단 응력 하에서 암성 및 비암성 세포의 기계적 특성과 거동에 대한 광범위한 연구를 위한 전단 분석 프로토콜을 제공합니다. 세포는 탄성 있고 점성이있는 방식으로 외력에 반응하므로 점탄성 물질3로 이상화 될 수 있습니다. 이 기술은 (i) 분산된 단일 세포의 세포 배양, (ii) 유체 전단 응력의 제어된 적용, (iii) 세포 거동의 현장 이미징 및 관찰(응력 및 변형에 대한 내성 포함), (iv) 변형 정도를 결정하기 위한 세포의 변형률 분석, (v) 단일 세포의 점탄성 특성 특성화로 분류됩니다. 이러한 기계적 특성과 거동을 조사함으로써 복잡한 세포 역학을 정량화 가능한 데이터로 증류할 수 있습니다. 이 방법을 설명하는 프로토콜은 다양한 악성 및 비악성 세포 유형을 분류하고 비교할 수 있습니다. 이러한 차이를 정량화하면 진단 및 치료 바이오마커를 확립할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포와 주변의 기계적 미세 환경 및 기계적 응력에 대한 반응을 시뮬레이션하기 위해 유사 기계 생물학적 환경을 설정하는 것을 포함하는 전단 분석 방법은 세포 기계적 특성 카탈로그를 생성했으며, 그 패턴은 암 세포주 3,4,5,7,8 사이에서 보존 된 물리적 이형성을 보여줍니다 </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 기술을 처음 개척한 Worcester Polytechnic Institute의 Soboyejo 그룹의 이전 연구원인 Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu 및 Vanessa Uzonwanne에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 암 연구소 (NIH / NCI K22 CA258410 to M.D.)의 지원을 받았다. 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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