Skjæranalyseprotokoll for bestemmelse av encellede materialegenskaper
Summary
Denne protokollen skisserer kvantifiseringen av de mekaniske egenskapene til kreft- og ikke-kreftcellelinjer in vitro. Bevarte forskjeller i mekanikken til kreft og normale celler kan fungere som en biomarkør som kan ha implikasjoner i prognose og diagnose.
Abstract
Uregelmessig biomekanikk er et kjennetegn på kreftbiologi som er gjenstand for omfattende studier. De mekaniske egenskapene til en celle ligner på et materiale. En celles motstand mot stress og belastning, dens avslapningstid og dens elastisitet er alle egenskaper som kan utledes og sammenlignes med andre typer celler. Kvantifisering av de mekaniske egenskapene til kreft (ondartet) versus normale (ikke-ondartede) celler gjør det mulig for forskere å avdekke de biofysiske grunnleggende av denne sykdommen. Mens de mekaniske egenskapene til kreftceller er kjent for å konsekvent avvike fra de mekaniske egenskapene til normale celler, mangler en standard eksperimentell prosedyre for å utlede disse egenskapene fra celler i kultur.
Denne artikkelen skisserer en prosedyre for å kvantifisere de mekaniske egenskapene til enkeltceller in vitro ved hjelp av en væskeskjæranalyse. Prinsippet bak denne analysen innebærer å påføre væskeskjærspenning på en enkelt celle og optisk overvåke den resulterende cellulære deformasjonen over tid. Cellemekaniske egenskaper karakteriseres deretter ved hjelp av digital bildekorrelasjonsanalyse (DIC) og tilpasning av en passende viskoelastisk modell til eksperimentelle data generert fra DIC-analysen. Samlet sett har protokollen som er skissert her som mål å gi en mer effektiv og målrettet metode for diagnostisering av vanskelig å behandle kreft.
Introduction
Å studere de biofysiske forskjellene mellom kreft- og ikke-kreftceller gir nye diagnostiske og terapeutiske muligheter1. Å forstå hvordan forskjeller i biomekanikk / mekanobiologi bidrar til tumorprogresjon og behandlingsresistens vil avsløre nye veier for målrettet terapi og tidlig diagnose2.
Selv om det er kjent at kreftcellenes mekaniske egenskaper skiller seg fra normale celler (f.eks. viskoelastisiteten til plasmamembranen og nukleær konvolutt)3,4,5, mangler robuste og reproduserbare metoder for å måle disse egenskapene i levende celler6. Skjæranalysemetoden brukes til å kvantifisere de mekaniske egenskapene til celler ved å utsette enkeltceller for væskeskjærspenning og analysere deres individuelle responser og motstand mot den påførte spenningen 3,4,5,7,8,9. Selv om flere metoder og teknikker har blitt brukt til å karakterisere de mekaniske egenskapene til enkeltceller, har disse en tendens til å påvirke cellematerialets egenskaper ved å i) perforere / skade cellemembranen på grunn av innrykksdybden, komplekse spissgeometrier eller substratavstivning assosiert med atomkraftmikroskopi (AFM) 10,11, ii) indusere cellulær fotoskade under optisk fangst 12, 13, eller iii) indusere komplekse stresstilstander assosiert med mikropipetteaspirasjon14,15. Disse eksterne effektene er forbundet med betydelige usikkerheter i nøyaktigheten av celleviskoelastisitetsmålinger 6,16,17.
For å løse disse begrensningene gir skjæranalysemetoden beskrevet her en svært kontrollerbar og enkel tilnærming for å simulere fysiologisk strømning i kroppen uten å påvirke cellulære materialegenskaper i prosessen. Væskeskjærspenninger i denne analysen representerer mekaniske påkjenninger som oppleves av celler i kroppen enten av væsker i tumorinterstitium eller i blodet under sirkulasjon18,19,20. Videre fremmer disse væskespenningene ulike ondartede atferd i kreftceller, inkludert progresjon, migrasjon, metastase og celledød 19,21,22,23 som varierer mellom tumorigene og ikke-tumorigene celler. Videre tillater de endrede mekaniske egenskapene til kreftceller (dvs. de er ofte “mykere” enn normale celler som finnes i samme organ) at de vedvarer i fiendtlige tumormikromiljøer, invaderer omkringliggende normalt vev og metastaserer til fjerne steder24,25,26. Ved å skape et pseudobiologisk miljø hvor celler opplever fysiologiske nivåer av væskeskjærspenning, oppnås en prosess som er fysiologisk relevant og ikke ødeleggende for cellen. De cellulære responsene på disse påførte væskeskjærspenningene tillater oss å karakterisere cellemekaniske egenskaper.
Dette papiret gir en skjæranalyseprotokoll for den omfattende studien av de mekaniske egenskapene og oppførselen til kreft- og ikke-kreftceller under påført skjærspenning. Celler reagerer på ytre krefter på en elastisk og viskøs måte og kan derfor idealiseres som et viskoelastisk materiale3. Denne teknikken er kategorisert i: (i) cellekultur av dispergerte enkeltceller, (ii) kontrollert anvendelse av væskeskjærspenning, (iii) in situ-avbildning og observasjon av cellulær oppførsel (inkludert motstand mot stress og deformasjon), (iv) belastningsanalyse av celler for å bestemme omfanget av deformasjon, og (v) karakterisering av de viskoelastiske egenskapene til enkeltceller. Ved å undersøke disse mekaniske egenskapene og atferdene, kan kompleks cellulær mekanobiologi destilleres til kvantifiserbare data. En protokoll som beskriver denne metoden gjør det mulig å katalogisere og sammenligne mellom forskjellige ondartede og ikke-ondartede celletyper. Kvantifisering av disse forskjellene har potensial til å etablere diagnostiske og terapeutiske biomarkører.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skjæranalysemetoden, som inkluderer å sette opp et pseudo-mekanobiologisk miljø for å simulere samspillet mellom celler med det omkringliggende mekaniske mikromiljøet og deres respons på mekaniske påkjenninger, har produsert en katalog over cellulære mekaniske egenskaper, hvis mønstre viser konservert fysisk atypi blant kreftcellelinjer 3,4,5,7,8 . De…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker tidligere forskere fra Soboyejo-gruppen ved Worcester Polytechnic Institute som først var banebrytende for denne teknikken: Dr. Yifang Cao, Jingjie Hu og Vanessa Uzonwanne. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 til MD). Figurer ble laget med BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
