Protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular
Summary
Este protocolo describe la cuantificación de las propiedades mecánicas de líneas celulares cancerosas y no cancerosas in vitro. Las diferencias conservadas en la mecánica de las células cancerosas y normales pueden actuar como un biomarcador que puede tener implicaciones en el pronóstico y el diagnóstico.
Abstract
La biomecánica irregular es un sello distintivo de la biología del cáncer sujeto a un extenso estudio. Las propiedades mecánicas de una célula son similares a las de un material. La resistencia de una célula al estrés y la tensión, su tiempo de relajación y su elasticidad son propiedades que se pueden derivar y comparar con otros tipos de células. La cuantificación de las propiedades mecánicas de las células cancerosas (malignas) frente a las normales (no malignas) permite a los investigadores descubrir aún más los fundamentos biofísicos de esta enfermedad. Si bien se sabe que las propiedades mecánicas de las células cancerosas difieren consistentemente de las propiedades mecánicas de las células normales, falta un procedimiento experimental estándar para deducir estas propiedades de las células en cultivo.
Este documento describe un procedimiento para cuantificar las propiedades mecánicas de células individuales in vitro utilizando un ensayo de cizallamiento de fluidos. El principio detrás de este ensayo consiste en aplicar tensión de cizallamiento de fluido en una sola célula y monitorear ópticamente la deformación celular resultante a lo largo del tiempo. Las propiedades mecánicas celulares se caracterizan posteriormente mediante el análisis de correlación digital de imágenes (DIC) y el ajuste de un modelo viscoelástico apropiado a los datos experimentales generados a partir del análisis DIC. En general, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo proporcionar un método más eficaz y específico para el diagnóstico de cánceres difíciles de tratar.
Introduction
El estudio de las diferencias biofísicas entre las células cancerosas y no cancerosas permite nuevas oportunidades diagnósticas y terapéuticas1. Comprender cómo las diferencias en biomecánica / mecanobiología contribuyen a la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento revelará nuevas vías para la terapia dirigida y el diagnóstico temprano2.
Si bien se sabe que las propiedades mecánicas de las células cancerosas difieren de las células normales (por ejemplo, la viscoelasticidad de la membrana plasmática y la envoltura nuclear)3,4,5, faltan métodos robustos y reproducibles para medir estas propiedades en células vivas6. El método de ensayo de cizallamiento se utiliza para cuantificar las propiedades mecánicas de las células sometiendo células individuales a tensión de cizallamiento del fluido y analizando sus respuestas individuales y resistencia a la tensión aplicada 3,4,5,7,8,9. Aunque se han utilizado varios métodos y técnicas para caracterizar las propiedades mecánicas de células individuales, éstas tienden a afectar las propiedades del material celular i) perforando/dañando la membrana celular debido a la profundidad de indentación, geometrías complejas de la punta o rigidez del sustrato asociado con la microscopía de fuerza atómica (AFM)10,11, ii) induciendo fotodaño celular durante el atrapamiento óptico 12, 13, o iii) inducir estados complejos de estrés asociados a la aspiración de micropipetas14,15. Estos efectos externos están asociados con incertidumbres significativas en la precisión de las mediciones de viscoelasticidad celular 6,16,17.
Para abordar estas limitaciones, el método de ensayo de cizallamiento descrito aquí proporciona un enfoque altamente controlable y simple para simular el flujo fisiológico en el cuerpo sin afectar las propiedades del material celular en el proceso. Las tensiones de cizallamiento de fluidos en este ensayo representan tensiones mecánicas experimentadas por las células en el cuerpo, ya sea por fluidos dentro del intersticio tumoral o en la sangre durante la circulación18,19,20. Además, estas tensiones fluidas promueven diversos comportamientos malignos en las células cancerosas, incluyendo progresión, migración, metástasis y muerte celular 19,21,22,23 que varían entre células tumorigénicas y no tumorígenas. Además, las características mecánicas alteradas de las células cancerosas (es decir, a menudo son “más blandas” que las células normales que se encuentran dentro del mismo órgano) les permiten persistir en microambientes tumorales hostiles, invadir los tejidos normales circundantes y hacer metástasis a sitios distantes24,25,26. Al crear un entorno pseudobiológico donde las células experimentan niveles fisiológicos de estrés de cizallamiento del fluido, se logra un proceso que es fisiológicamente relevante y no destructivo para la célula. Las respuestas celulares a estas tensiones de cizallamiento de fluido aplicadas nos permiten caracterizar las propiedades mecánicas celulares.
Este documento proporciona un protocolo de ensayo de cizallamiento para el estudio exhaustivo de las propiedades mecánicas y el comportamiento de las células cancerosas y no cancerosas bajo estrés de cizallamiento aplicado. Las células responden a las fuerzas externas de manera elástica y viscosa y, por lo tanto, pueden idealizarse como un material viscoelástico3. Esta técnica se clasifica en: (i) cultivo celular de células individuales dispersas, (ii) aplicación controlada de esfuerzo cortante de fluido, (iii) imágenes in situ y observación del comportamiento celular (incluida la resistencia al estrés y la deformación), (iv) análisis de deformación de células para determinar el grado de deformación, y (v) caracterización de las propiedades viscoelásticas de células individuales. Al interrogar estas propiedades y comportamientos mecánicos, la mecanobiología celular compleja se puede destilar a datos cuantificables. Un protocolo que describe este método permite la catalogación y comparación entre varios tipos de células malignas y no malignas. La cuantificación de estas diferencias tiene el potencial de establecer biomarcadores diagnósticos y terapéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de ensayo de cizallamiento, que incluye la creación de un entorno pseudomecanobiológico para simular la interacción de las células con el microambiente mecánico circundante y sus respuestas a las tensiones mecánicas, ha producido un catálogo de propiedades mecánicas celulares, cuyos patrones muestran atipia física conservada entre líneas celulares cancerosas 3,4,5,7,8 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los investigadores anteriores del grupo Soboyejo en el Instituto Politécnico de Worcester que fueron pioneros en esta técnica: los doctores Yifang Cao, Jingjie Hu y Vanessa Uzonwanne. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (NIH/NCI K22 CA258410 a M.D.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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