Skjuvanalysprotokoll för bestämning av encelliga materialegenskaper
Summary
Detta protokoll beskriver kvantifieringen av de mekaniska egenskaperna hos cancerösa och icke-cancerösa cellinjer in vitro. Bevarade skillnader i mekaniken hos cancerceller och normala celler kan fungera som en biomarkör som kan få konsekvenser för prognos och diagnos.
Abstract
Oregelbunden biomekanik är ett kännetecken för cancerbiologi som är föremål för omfattande studier. De mekaniska egenskaperna hos en cell liknar dem hos ett material. En cells motståndskraft mot stress och belastning, dess avslappningstid och dess elasticitet är alla egenskaper som kan härledas och jämföras med andra typer av celler. Kvantifiering av de mekaniska egenskaperna hos cancer (maligna) kontra normala (icke-maligna) celler gör det möjligt för forskare att ytterligare avslöja de biofysiska grunderna för denna sjukdom. Medan de mekaniska egenskaperna hos cancerceller är kända för att konsekvent skilja sig från de mekaniska egenskaperna hos normala celler, saknas ett standardexperimentellt förfarande för att härleda dessa egenskaper från celler i odling.
Detta dokument beskriver ett förfarande för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler in vitro med hjälp av en vätskeskjuvningsanalys. Principen bakom denna analys innebär att vätskeskjuvspänning appliceras på en enda cell och optiskt övervakar den resulterande cellulära deformationen över tiden. Cellmekaniska egenskaper karakteriseras därefter med hjälp av digital bildkorrelation (DIC) -analys och anpassning av en lämplig viskoelastisk modell till experimentella data som genereras från DIC-analysen. Sammantaget syftar det protokoll som beskrivs här till att tillhandahålla en effektivare och mer målinriktad metod för diagnos av svårbehandlade cancerformer.
Introduction
Att studera de biofysiska skillnaderna mellan cancerceller och icke-cancerceller möjliggör nya diagnostiska och terapeutiska möjligheter1. Att förstå hur skillnader i biomekanik / mekanobiologi bidrar till tumörprogression och behandlingsresistens kommer att avslöja nya vägar för riktad terapi och tidig diagnos2.
Även om det är känt att cancercellernas mekaniska egenskaper skiljer sig från normala celler (t.ex. viskoelasticitet hos plasmamembranet och kärnhöljet)3,4,5, saknas robusta och reproducerbara metoder för att mäta dessa egenskaper i levande celler6. Skjuvanalysmetoden används för att kvantifiera cellernas mekaniska egenskaper genom att utsätta enskilda celler för vätskeskjuvspänning och analysera deras individuella svar och motstånd mot den applicerade spänningen 3,4,5,7,8,9. Även om flera metoder och tekniker har använts för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler, tenderar dessa att påverka cellmaterialets egenskaper genom att i) perforera / skada cellmembranet på grund av indragningsdjupet, komplexa spetsgeometrier eller substratförstyvning associerad med atomkraftmikroskopi (AFM) 10,11, ii) inducerande cellulär fotodamage under optisk fångst 12, 13, eller iii) inducerande av komplexa spänningstillstånd associerade med mikropipettaspiration14,15. Dessa externa effekter är förknippade med signifikanta osäkerheter i noggrannheten hos cellviskoelasticitetsmätningar 6,16,17.
För att ta itu med dessa begränsningar ger skjuvanalysmetoden som beskrivs här ett mycket kontrollerbart och enkelt tillvägagångssätt för att simulera fysiologiskt flöde i kroppen utan att påverka cellulära materialegenskaper i processen. Vätskeskjuvspänningar i denna analys representerar mekaniska påfrestningar som upplevs av celler i kroppen antingen av vätskor i tumörinterstitium eller i blodet under cirkulation18,19,20. Vidare främjar dessa vätskespänningar olika maligna beteenden i cancerceller, inklusive progression, migration, metastasering och celldöd 19,21,22,23 som varierar mellan tumörframkallande och icke-tumörframkallande celler. Dessutom tillåter de förändrade mekaniska egenskaperna hos cancerceller (dvs de är ofta “mjukare” än normala celler som finns inom samma organ) dem att kvarstå i fientliga tumörmikromiljöer, invadera omgivande normala vävnader och metastasera till avlägsna platser24,25,26. Genom att skapa en pseudobiologisk miljö där celler upplever fysiologiska nivåer av vätskeskjuvspänning uppnås en process som är fysiologiskt relevant och inte destruktiv för cellen. De cellulära svaren på dessa applicerade vätskeskjuvspänningar tillåter oss att karakterisera cellmekaniska egenskaper.
Detta dokument tillhandahåller ett skjuvanalysprotokoll för omfattande studier av de mekaniska egenskaperna och beteendet hos cancerceller och icke-cancerceller under applicerad skjuvspänning. Celler svarar på yttre krafter på ett elastiskt och visköst sätt och kan därför idealiseras som ett viskoelastiskt material3. Denna teknik kategoriseras i: (i) cellodling av dispergerade enskilda celler, (ii) kontrollerad applicering av vätskeskjuvspänning, (iii) in situ-avbildning och observation av cellulärt beteende (inklusive motståndskraft mot stress och deformation), (iv) töjningsanalys av celler för att bestämma graden av deformation, och (v) karakterisering av de viskoelastiska egenskaperna hos enskilda celler. Genom att undersöka dessa mekaniska egenskaper och beteenden kan komplex cellulär mekanobiologi destilleras till kvantifierbara data. Ett protokoll som beskriver denna metod möjliggör katalogisering av och jämförelse mellan olika maligna och icke-maligna celltyper. Att kvantifiera dessa skillnader har potential att etablera diagnostiska och terapeutiska biomarkörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skjuvanalysmetoden, som inkluderar att inrätta en pseudo-mekanobiologisk miljö för att simulera cellernas interaktion med den omgivande mekaniska mikromiljön och deras svar på mekaniska påfrestningar, har producerat en katalog över cellulära mekaniska egenskaper, vars mönster visar bevarad fysisk atypi bland cancercellinjer 3,4,5,7,8 . Denna metod kom…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar tidigare forskare från Soboyejo-gruppen vid Worcester Polytechnic Institute som först var banbrytande för denna teknik: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu och Vanessa Uzonwanne. Detta arbete stöddes av National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 till MD). Siffror skapades med BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
