احتباس جزيئي عالمي مع مجهر تمدد 11 ضعفا
Summary
يظهر هنا إصدار جديد من الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، Magnify ، والذي تم تعديله لتوسع يصل إلى 11 ضعفا ، مع الحفاظ على مجموعة شاملة من فئات الجزيئات الحيوية ، وهو متوافق مع مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. إنه يتيح استجواب التكوين النانوي للجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر التقليدية المحدودة الحيود.
Abstract
يمكن للتصوير النانوي للعينات البيولوجية تحسين فهم التسبب في المرض. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن الفحص المجهري التوسعي (ExM) بديل فعال ومنخفض التكلفة للفحص المجهري البصري فائق الدقة. ومع ذلك ، فقد تم تقييده بسبب الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة وغالبا ما تكون مخصصة للاحتفاظ بفئات مختلفة من الجزيئات الحيوية داخل الجل وبسبب الصعوبات في توسيع تنسيقات العينات السريرية القياسية ، مثل الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين ، خاصة إذا كانت عوامل التمدد الأكبر أو حوامل البروتين المحفوظة مطلوبة. هنا ، نصف Magnify ، وهي طريقة ExM جديدة للتوسع القوي حتى 11 ضعفا في مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. باستخدام الميثاكرولين كمرساة كيميائية بين الأنسجة والهلام ، يحتفظ Magnify بجزيئات حيوية متعددة ، مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية ، داخل الهلام ، مما يسمح بالتصوير النانوي الواسع للأنسجة على المجاهر الضوئية التقليدية. يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات لضمان تمدد الأنسجة القوي والخالي من التشققات ، بالإضافة إلى نصائح للتعامل مع المواد الهلامية الموسعة للغاية وتصويرها.
Introduction
تظهر الأنظمة البيولوجية عدم تجانس هيكلي ، من الأطراف والأعضاء وصولا إلى مستويات البروتينات على المستوى النانوي. لذلك ، يتطلب الفهم الكامل لتشغيل هذه الأنظمة فحصا بصريا عبر مقاييس الحجم هذه. ومع ذلك ، فإن حد حيود الضوء يسبب تحديات في تصور الهياكل الأصغر من ~ 200-300 نانومتر على مجهر مضان تقليدي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطرق البصرية فائقة الدقة1،2،3 ، مثل استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، والمجهر التعريبي المنشط بالصور (PALM) ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، والمجهر الضوئي للإضاءة الهيكلية (SIM) ، على الرغم من قوتها ، تمثل تحدياتها الخاصة ، لأنها تتطلب أجهزة وكواشف باهظة الثمن وغالبا ما يكون لها أوقات اكتساب بطيئة وقدرة ضعيفة على تصوير كميات كبيرة في 3D.
يوفر الفحص المجهري التوسعي4 (ExM) وسيلة بديلة للتحايل على حد حيود الضوء عن طريق تثبيت الجزيئات الحيوية تساهميا في هلام بوليمر قابل للانتفاخ بالماء وسحبها جسديا ، مما يجعلها قابلة للحل على المجاهر الضوئية التقليدية. تم تطوير العديد من متغيرات بروتوكول ExM منذ النشر الأصلي ل ExM قبل أقل من عقد من الزمان ، وتسمح هذه البروتوكولات بالدمج المباشر للبروتينات5،6،7 أو RNA8،9،10 أو الدهون11،12،13 في شبكة الهلام عن طريق تغيير المرساة الكيميائية أو توسيع العينة بشكل أكبر (وبالتالي تحسين الدقة الفعالة) إما في خطوة واحدة14 أو خطوات تكرارية متعددة15,16. حتى وقت قريب ، لا يمكن لأي بروتوكول ExM واحد الاحتفاظ بهذه الفئات الثلاث من الجزيئات الحيوية مع مرساة كيميائية واحدة متاحة تجاريا مع توفير هلام قوي ميكانيكيا يمكن أن يتوسع ~ 10 أضعاف في جولة توسع واحدة.
هنا ، نقدم Magnify17 ، وهي إضافة حديثة إلى ترسانة ExM التي تستخدم الميثاكرولين كمرساة للجزيء الحيوي. يشكل الميثاكرولين روابط تساهمية مع أنسجة مثل تلك الموجودة في بارافورمالدهيد ، مما يضمن إمكانية الاحتفاظ بفئات متعددة من الجزيئات الحيوية داخل شبكة الهلام دون الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة أو مخصصة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية توسيع نطاق واسع من الأنسجة حتى 11 ضعفا ، بما في ذلك العينات الصعبة المعروفة مثل العينات السريرية المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE). تطلبت الطرق السابقة لتوسيع مثل هذه العينات الصلبة ميكانيكيا هضم البروتياز القاسي ، مما يجعل وضع علامات على الأجسام المضادة للبروتينات ذات الأهمية مستحيلا بعد توسيع العينة. في المقابل ، تحقق هذه التقنية توسيع العينات السريرية FFPE باستخدام محلول تغيير الطبيعة الساخن ، وبالتالي الحفاظ على حوائط البروتين الكاملة داخل الجل ، والتي يمكن استهدافها للتصوير بعد التمدد (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكول Magnify 17 ، وهو متغير ExM يمكنه الاحتفاظ بجزيئات حيوية متعددة مع مرساة كيميائية واحدة وتوسيع العينات السريرية FFPE الصعبة حتى11 ضعفا مع تمسخ الحرارة. تشمل التغييرات الرئيسية في هذا البروتوكول التي تميزه عن بروتوكولات ExM الأخرى استخدام هلام معاد صياغته يظل قويا مي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل جامعة كارنيجي ميلون ومؤسسة D.S.F. الخيرية (YZ و X.R.) ، والمعاهد الوطنية للصحة (N.I.H.) جائزة المخرج المبتكر الجديد DP2 OD025926-01 ، ومؤسسة كوفمان.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
