采用 11 倍扩增显微镜的通用分子保留
Summary
这里展示的是新版本的扩增显微镜（ExM），放大，经过修改可扩展高达11倍，保留全面的生物分子类别，并与多种组织类型兼容。它能够使用传统的衍射极限显微镜询问生物分子的纳米级构型。
Abstract
生物标本的纳米级成像可以提高对疾病发病机制的认识。近年来，扩展显微镜（ExM）已被证明是光学超分辨率显微镜的有效且低成本的替代方案。然而，由于需要特定的且通常是定制的锚定剂来保留凝胶内不同的生物分子类别，以及难以扩展标准临床样品形式（例如福尔马林固定石蜡包埋的组织），特别是如果需要更大的扩增因子或保留的蛋白质表位，它受到了限制。在这里，我们描述了Magnify，这是一种新的ExM方法，可在各种组织类型中实现高达11倍的稳健扩增。通过使用甲基丙烯醛作为组织和凝胶之间的化学锚，Magnify在凝胶中保留了多种生物分子，例如蛋白质，脂质和核酸，从而允许在传统光学显微镜上对组织进行广泛的纳米级成像。该协议描述了确保稳定和无裂纹组织扩增的最佳实践，以及处理和成像高度扩增凝胶的技巧。
Introduction
生物系统表现出结构异质性，从四肢和器官到纳米级的蛋白质水平。因此，要全面了解这些系统的运行情况，需要对这些尺寸尺度进行目视检查。然而，光的衍射极限给在传统荧光显微镜上可视化小于~200-300nm的结构带来了挑战。此外，光学超分辨率方法1,2,3，如受激发射损耗（STED），光激活定位显微镜（PALM），随机光学重建显微镜（STORM）和结构照明显微镜（SIM），虽然功能强大，但也带来了自己的挑战，因为它们需要昂贵的硬件和试剂，并且通常采集时间慢，并且在3D中成像大体积的能力差。
膨胀显微镜4（ExM）提供了一种规避光衍射极限的替代方法，方法是将生物分子共价锚定到可水溶胀的聚合物凝胶中并将它们物理拉开，从而使它们在传统光学显微镜上可分辨。自不到十年前ExM首次发表以来，已经开发了多种ExM方案变体，这些方案允许直接掺入蛋白质5,6,7，RNA 8,9,10或脂质11,12,13通过在单个步骤14或多个迭代步骤15,16中改变化学锚或进一步扩展样品（从而提高有效分辨率）进入凝胶网络。直到最近，还没有一个单一的ExM协议可以用单一的市售化学锚保留这三种生物分子类别，同时提供机械坚固的凝胶，可以在单轮扩增中扩增~10倍。
在这里，我们介绍了Magnify17，这是ExM武器库中的最新成员，它使用甲基丙烯醛作为生物分子锚。甲基丙烯醛与多聚甲醛等组织形成共价键，确保多类生物分子可以保留在凝胶网络中，而无需各种特异性或定制的锚定剂。此外，该技术可以将广谱组织扩展多达 11 倍，包括众所周知具有挑战性的样品，例如福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 临床样品。以前扩增这种机械刚性样品的方法需要严格的蛋白酶消化，使得在样品扩增后无法对感兴趣的蛋白质进行抗体标记。相比之下，该技术使用热变性溶液实现FFPE临床样品的扩增，从而保留凝胶内的整个蛋白质表位，可以靶向扩增后成像（图1）。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们介绍了放大方案17，这是一种ExM变体，可以用单个化学锚保留多个生物分子，并通过热变性将具有挑战性的FFPE临床标本扩展至11倍。该方案区别于其他ExM方案的关键变化包括使用重新配制的凝胶，即使在完全扩增时也能保持机械坚固性，以及使用甲基丙烯醛作为生物分子锚。该方案中最关键的步骤如下：1）最终凝胶溶液的组成;2）凝胶化步骤的时间;3）凝胶室的设置…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了卡内基梅隆大学和DSF慈善基金会（Y.Z.和X.R.），美国国立卫生研究院（N.I.H.）的支持。导演新创新奖DP2 OD025926-01和考夫曼基金会。
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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