שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11
Summary
מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.
Abstract
הדמיה ננומטרית של דגימות ביולוגיות יכולה לשפר את ההבנה של פתוגנזה של מחלות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ הרחבה (ExM) הוכח כחלופה יעילה וזולה למיקרוסקופ אופטי ברזולוציית על. עם זאת, הוא הוגבל על ידי הצורך בסוכני עיגון ספציפיים ולעתים קרובות מותאמים אישית כדי לשמור על מחלקות ביומולקולות שונות בתוך הג’ל ועל ידי קשיים בהרחבת פורמטים סטנדרטיים של דגימות קליניות, כגון רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין, במיוחד אם רוצים גורמי התפשטות גדולים יותר או אפיטופים חלבוניים משומרים. במאמר זה אנו מתארים את Magnify, שיטת ExM חדשה להרחבה חזקה עד פי 11 במגוון רחב של סוגי רקמות. על ידי שימוש במתקרולאין כעוגן כימי בין הרקמה לג’ל, Magnify שומרת על ביומולקולות מרובות, כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין, בתוך הג’ל, ובכך מאפשרת הדמיה ננומטרית רחבה של רקמות על מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מתאר שיטות עבודה מומלצות כדי להבטיח הרחבת רקמות חזקה ונטולת סדקים, כמו גם טיפים לטיפול והדמיה של ג’לים מורחבים מאוד.
Introduction
מערכות ביולוגיות מפגינות הטרוגניות מבנית, החל מהגפיים והאיברים ועד לרמות החלבונים בסקאלה הננומטרית. לכן, הבנה מלאה של פעולת מערכות אלה מחייבת בחינה ויזואלית על פני קני מידה אלה. עם זאת, מגבלת העקיפה של האור גורמת לאתגרים בהדמיה של מבנים קטנים מ~200-300 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בנוסף, שיטות אופטיות ברזולוציית על 1,2,3, כגון דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופ לוקליזציה מופעל אור (PALM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), למרות שהן חזקות, מציבות אתגרים משלהן, מכיוון שהן דורשות חומרה וריאגנטים יקרים ולעתים קרובות יש להן זמני רכישה איטיים ויכולת ירודה לצלם נפחים גדולים בתלת-ממד.
מיקרוסקופ הרחבה4 (ExM) מספק אמצעי חלופי לעקוף את גבול העקיפה של האור על ידי עיגון קוולנטי של ביומולקולות לג’ל פולימרי מתנפח במים ומשיכה פיזית שלהן זו מזו, ובכך להפוך אותן לפתרון במיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי. מספר רב של גרסאות פרוטוקול ExM פותחו מאז הפרסום המקורי של ExM לפני פחות מעשור, ופרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב ישיר של חלבונים 5,6,7, RNA 8,9,10, או שומנים11,12,13 לתוך רשת הג’ל על ידי שינוי העוגן הכימי או הרחבת הדגימה עוד יותר (ובכך לשפר את הרזולוציה האפקטיבית) בשלב אחד14 או בשלבים איטרטיביים מרובים15,16. עד לאחרונה, אף פרוטוקול ExM יחיד לא יכול היה לשמור על שלוש מחלקות ביומולקולות אלה עם עוגן כימי יחיד הזמין מסחרית תוך מתן ג’ל חזק מכנית שיכול להתרחב ~ פי 10 בסבב התפשטות יחיד.
כאן, אנו מציגים את Magnify17, תוספת עדכנית לארסנל ExM המשתמשת במתקרולאין כעוגן ביומולקולה. מתקרוליין יוצר קשרים קוולנטיים עם רקמה כמו זו של פרפורמלדהיד, מה שמבטיח שניתן לשמור על סוגים מרובים של ביומולקולות בתוך רשת הג’ל ללא צורך בסוכני עיגון ספציפיים או מותאמים אישית. בנוסף, טכניקה זו יכולה להרחיב ספקטרום רחב של רקמות עד פי 11, כולל דגימות מאתגרות לשמצה כגון דגימות קליניות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE). שיטות קודמות להרחבת דגימות קשיחות מכניות כאלה דרשו עיכול פרוטאז קשה, מה שהפך את סימון הנוגדנים של חלבונים מעניינים לבלתי אפשרי לאחר הרחבת הדגימה. לעומת זאת, שיטה זו משיגה הרחבה של דגימות קליניות מסוג FFPE באמצעות תמיסת דנטורינג חם, ובכך משמרת אפיטופים של חלבונים שלמים בתוך הג’ל, שניתן לכוון אליהם לצורך הדמיה לאחר הרחבה (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול Magnify17, גרסת ExM שיכולה לשמור על ביומולקולות מרובות עם עוגן כימי יחיד ולהרחיב דגימות קליניות מאתגרות של FFPE עד פי 11 עם דנטורציה של חום. השינויים העיקריים בפרוטוקול זה המבדילים אותו מפרוטוקולי ExM אחרים כוללים שימוש בג’ל מנוסח מחדש שנשאר חזק מכנית גם כאשר …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קרנגי מלון וקרן הצדקה D.S.F. (Y.Z. ו- X.R.), המכונים הלאומיים לבריאות (N.I.H.) פרס הבמאי החדשן החדש DP2 OD025926-01, וקרן קאופמן.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
