11-गुना विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ सार्वभौमिक आणविक प्रतिधारण
Summary
यहां प्रस्तुत विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम), मैग्नीफाई का एक नया संस्करण है, जिसे 11 गुना विस्तार के लिए संशोधित किया गया है, बायोमोलेक्यूल वर्गों की एक व्यापक सरणी का संरक्षण करता है, और ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है। यह पारंपरिक विवर्तन-सीमित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स के नैनोस्केल विन्यास की पूछताछ को सक्षम बनाता है।
Abstract
जैविक नमूनों की नैनोस्केल इमेजिंग रोग रोगजनन की समझ में सुधार कर सकती है। हाल के वर्षों में, विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रभावी और कम लागत वाला विकल्प साबित हुआ है। हालांकि, जेल के भीतर विभिन्न बायोमोलेक्यूल वर्गों को बनाए रखने के लिए विशिष्ट और अक्सर कस्टम एंकरिंग एजेंटों की आवश्यकता और मानक नैदानिक नमूना प्रारूपों के विस्तार में कठिनाइयों से सीमित किया गया है, जैसे कि फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक, खासकर अगर बड़े विस्तार कारक या संरक्षित प्रोटीन एपिटोप वांछित हैं। यहां, हम मैग्नीफाई का वर्णन करते हैं, जो ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में 11 गुना तक मजबूत विस्तार के लिए एक नई एक्सएम विधि है। ऊतक और जेल के बीच रासायनिक लंगर के रूप में मेथाक्रोलिन का उपयोग करके, मैग्नीफाई जेल के भीतर प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड जैसे कई बायोमोलेक्यूल्स को बरकरार रखता है, इस प्रकार पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर ऊतकों की व्यापक नैनोस्केल इमेजिंग की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल मजबूत और दरार मुक्त ऊतक विस्तार सुनिश्चित करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का वर्णन करता है, साथ ही अत्यधिक विस्तारित जैल को संभालने और इमेजिंग करने के लिए सुझाव देता है।
Introduction
जैविक प्रणालियां नैनोस्केल में प्रोटीन के स्तर तक अंगों और अंगों से संरचनात्मक विषमता प्रदर्शित करती हैं। इसलिए, इन प्रणालियों के संचालन की पूरी समझ के लिए इन आकार के पैमानों पर दृश्य परीक्षा की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रकाश की विवर्तन सीमा पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर ~ 200-300 एनएम से छोटी संरचनाओं को देखने में चुनौतियों का कारण बनती है। इसके अलावा, ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियां 1,2,3, जैसे उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी), फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम), स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), हालांकि शक्तिशाली, अपनी चुनौतियां पेश करते हैं, क्योंकि उन्हें महंगे हार्डवेयर और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और अक्सर धीमी गति से अधिग्रहण समय और 3 डी में बड़ी मात्रा की छवि बनाने की खराब क्षमता होती है।
विस्तार माइक्रोस्कोपी4 (ईएक्सएम) बायोमोलेक्यूल्स को पानी-सूजन वाले बहुलक जेल में सहसंयोजक रूप से लंगर डालकर और शारीरिक रूप से उन्हें अलग करके प्रकाश की विवर्तन सीमा को दरकिनार करने का एक वैकल्पिक साधन प्रदान करता है, इस प्रकार उन्हें पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर हल करने योग्य बनाता है। एक दशक से भी कम समय पहले एक्सएम के मूल प्रकाशन के बाद से एक्सएम प्रोटोकॉल वेरिएंट की एक भीड़ विकसित की गई है, और ये प्रोटोकॉल प्रोटीन 5,6,7, आरएनए 8,9,10, या लिपिड11,12,13 के प्रत्यक्ष समावेश की अनुमति देते हैं। रासायनिक लंगर को बदलकर या नमूने को आगे विस्तारित करके जेल नेटवर्क में (इस प्रकार प्रभावी रिज़ॉल्यूशन में सुधार) या तो एक ही चरण14 या कई पुनरावृत्ति चरण15,16 में। हाल तक, कोई भी एक्सएम प्रोटोकॉल इन तीन बायोमोलेक्यूल वर्गों को एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रासायनिक लंगर के साथ बनाए नहीं रख सकता था, जबकि यांत्रिक रूप से मजबूत जेल प्रदान करता था जो एकल विस्तार दौर में ~ 10 गुना विस्तार कर सकता था।
यहां, हम मैग्नीफाई17 प्रस्तुत करते हैं, जो एक्सएम शस्त्रागार के लिए एक हालिया अतिरिक्त है जो बायोमोलेक्यूल एंकर के रूप में मेथाक्रोलिन का उपयोग करता है। मेथाक्रोलिन पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे ऊतक के साथ सहसंयोजक बंधन बनाता है, यह सुनिश्चित करता है कि विभिन्न विशिष्ट या कस्टम एंकरिंग एजेंटों की आवश्यकता के बिना जेल नेटवर्क के भीतर बायोमोलेक्यूल्स के कई वर्गों को बनाए रखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक ऊतकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को 11 गुना तक बढ़ा सकती है, जिसमें फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) नैदानिक नमूने जैसे कुख्यात चुनौतीपूर्ण नमूने शामिल हैं। इस तरह के यांत्रिक रूप से कठोर नमूनों के विस्तार के लिए पिछले तरीकों में कठोर प्रोटीज पाचन की आवश्यकता होती है, जिससे नमूने का विस्तार होने के बाद रुचि के प्रोटीन के एंटीबॉडी लेबलिंग असंभव हो जाते हैं। इसके विपरीत, यह तकनीक एक गर्म विकृत समाधान का उपयोग करके एफएफपीई नैदानिक नमूनों के विस्तार को प्राप्त करती है, इस प्रकार जेल के भीतर पूरे प्रोटीन एपिटोप्स को संरक्षित करती है, जिसे पोस्ट-विस्तार इमेजिंग (चित्रा 1) के लिए लक्षित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम मैग्नीफाई प्रोटोकॉल 17 प्रस्तुत करते हैं, एक एक्सएम संस्करण जो एक रासायनिक लंगर के साथ कई बायोमोलेक्यूल्स को बनाए रख सकता है और गर्मी विकृतीकरण के साथ चुनौतीपूर्ण एफएफपीई नैदानिक नमूनों को<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कार्नेगी मेलन विश्वविद्यालय और डीएसएफ चैरिटेबल फाउंडेशन (वाईजेड और एक्सआर), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) द्वारा समर्थित किया गया था। निर्देशक का नया इनोवेटर पुरस्कार डीपी 2 OD025926-01, और कॉफमैन फाउंडेशन।
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
