Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy(11배 팽창 현미경을 통한 범용 분자 유지)
Summary
여기에 제시된 확장 현미경(ExM)의 새로운 버전인 Magnify는 최대 11배 확장을 위해 수정되어 포괄적인 생체 분자 클래스 배열을 보존하고 광범위한 조직 유형과 호환됩니다. 이를 통해 기존의 회절 제한 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 크기 구성을 조사할 수 있습니다.
Abstract
생물학적 표본의 나노스케일 이미징은 질병 발병기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 팽창 현미경(ExM)은 광학 초고해상도 현미경에 대한 효과적이고 저렴한 대안으로 입증되었습니다. 그러나 겔 내에서 서로 다른 생체 분자 클래스를 유지하기 위한 특이적이고 종종 맞춤형 앵커링제의 필요성과 특히 더 큰 확장 인자 또는 보존된 단백질 에피토프가 필요한 경우 포르말린 고정 파라핀 포매 조직과 같은 표준 임상 샘플 형식을 확장하는 데 어려움이 있기 때문에 제한되었습니다. 여기에서는 다양한 조직 유형에서 최대 11배까지 강력하게 확장할 수 있는 새로운 ExM 방법인 Magnify에 대해 설명합니다. Magnify는 메타크롤레인을 조직과 겔 사이의 화학적 앵커로 사용함으로써 단백질, 지질 및 핵산과 같은 여러 생체 분자를 겔 내에 보유하므로 기존 광학 현미경에서 조직의 광범위한 나노 스케일 이미징이 가능합니다. 이 프로토콜은 견고하고 균열 없는 조직 확장을 보장하기 위한 모범 사례와 고도로 확장된 젤을 취급하고 이미징하기 위한 팁을 설명합니다.
Introduction
생물학적 시스템은 팔다리와 장기에서 나노 규모의 단백질 수준에 이르기까지 구조적 이질성을 나타냅니다. 따라서 이러한 시스템의 작동을 완전히 이해하려면 이러한 크기 척도에 대한 육안 검사가 필요합니다. 그러나 빛의 회절 한계는 기존 형광 현미경에서 ~200-300nm보다 작은 구조를 시각화하는 데 어려움을 야기합니다. 또한 STED(Stimulated Emission Depletion), PALM(Photo-Activated Localization Microscopy), STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 및 SIM(Structured Illumination Microscopy)과 같은 광학 초해상도 방법(1,2,3)은 강력하지만 값비싼 하드웨어와 시약이 필요하고 종종 획득 시간이 느리고 3D로 대량을 이미지화하는 능력이 떨어지기 때문에 고유한 문제를 제시합니다.
팽창 현미경4(ExM)는 생체 분자를 팽윤성 폴리머 겔에 공유 결합하고 물리적으로 분리하여 기존 광학 현미경에서 분해할 수 있도록 함으로써 빛의 회절 한계를 우회하는 대체 수단을 제공합니다. 10년 전 ExM이 처음 발표된 이후 다수의 ExM 프로토콜 변이체가 개발되었으며, 이러한 프로토콜은 단백질 5,6,7, RNA 8,9,10 또는 지질11,12,13의 직접적인 혼입을 가능하게 합니다 단일 단계(14) 또는 다중 반복 단계(15,16)에서 화학적 앵커를 변경하거나 샘플을 추가로 확장하여(따라서 유효 분리능을 개선시킴) 겔 네트워크 내로 유입시킨다. 최근까지 단일 ExM 프로토콜은 단일 확장 라운드에서 ~10배 확장할 수 있는 기계적으로 견고한 젤을 제공하면서 상업적으로 이용 가능한 단일 화학 앵커로 이 세 가지 생체 분자 클래스를 유지할 수 없었습니다.
여기에서는 메타크롤레인을 생체 분자 앵커로 사용하는 ExM 무기고에 최근 추가된 Magnify17을 소개합니다. 메타크롤레인은 파라포름알데히드와 같은 조직과 공유 결합을 형성하여 다양한 특정 또는 맞춤형 앵커링 에이전트 없이 여러 종류의 생체 분자를 겔 네트워크 내에 유지할 수 있도록 합니다. 또한 이 기술은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 임상 샘플과 같이 악명 높은 까다로운 샘플을 포함하여 광범위한 조직 스펙트럼을 최대 11배까지 확장할 수 있습니다. 이러한 기계적으로 단단한 샘플을 확장하기 위한 이전의 방법은 가혹한 프로테아제 분해가 필요했기 때문에 샘플이 확장된 후 관심 단백질의 항체 표지가 불가능했습니다. 대조적으로, 이 기술은 고온 변성 용액을 사용하여 FFPE 임상 샘플의 확장을 달성하여 겔 내에서 전체 단백질 에피토프를 보존하여 팽창 후 이미징을 목표로 할 수 있습니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 단일 화학 앵커로 여러 생체 분자를 유지하고 열 변성으로 까다로운 FFPE 임상 표본을 최대 11배까지 확장할 수 있는 ExM 변이체인 Magnify 프로토콜17을 제시합니다. 다른 ExM 프로토콜과 구별되는 이 프로토콜의 주요 변경 사항에는 완전히 확장된 경우에도 기계적으로 견고하게 유지되는 재구성된 젤의 사용과 생체 분자 앵커로 메타크롤레인의 사용이 포함됩니다. 이 프?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 카네기 멜론 대학 (Carnegie Mellon University)과 DSF 자선 재단 (YZ 및 XR), 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01 및 Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
