Универсальная молекулярная ретенция с 11-кратной расширительной микроскопией
Summary
Здесь представлена новая версия расширительной микроскопии (ExM) Magnify, которая модифицирована для расширения до 11 раз, сохраняет широкий спектр классов биомолекул и совместима с широким спектром типов тканей. Он позволяет исследовать наноразмерную конфигурацию биомолекул с помощью обычных дифракционно-ограниченных микроскопов.
Abstract
Наноразмерная визуализация биологических образцов может улучшить понимание патогенеза заболевания. В последние годы было продемонстрировано, что расширительная микроскопия (ExM) является эффективной и недорогой альтернативой оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Тем не менее, он был ограничен потребностью в специфических и часто индивидуальных якорных агентах для удержания различных классов биомолекул в геле, а также трудностями с расширением стандартных форматов клинических образцов, таких как фиксированная формалином парафинообразная ткань, особенно если требуются более крупные факторы расширения или сохраненные белковые эпитопы. В этой статье мы опишем Magnify, новый метод ExM для надежного расширения до 11 раз в широком спектре типов тканей. Используя метакролеин в качестве химического якоря между тканью и гелем, Magnify удерживает несколько биомолекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, внутри геля, что позволяет получать широкие наноразмерные изображения тканей на обычных оптических микроскопах. В этом протоколе описаны рекомендации по обеспечению прочного и свободного от трещин расширения тканей, а также советы по обращению и визуализации сильно расширенных гелей.
Introduction
Биологические системы демонстрируют структурную гетерогенность, начиная от конечностей и органов и заканчивая уровнями белков на наноуровне. Таким образом, полное понимание работы этих систем требует визуального осмотра в этих размерных масштабах. Однако дифракционный предел света вызывает трудности при визуализации структур размером менее ~200-300 нм с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Кроме того, оптические методысверхвысокого разрешения 1,2,3, такие как истощение вынужденного излучения (STED), фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM), стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) и микроскопия структурированной подсветки (SIM), хотя и являются мощными, представляют свои собственные проблемы, поскольку они требуют дорогостоящего оборудования и реагентов и часто имеют медленное время сбора данных и плохую способность отображать большие объемы в 3D.
Расширительная микроскопия4 (ExM) представляет собой альтернативный способ обхода дифракционного предела света путем ковалентного закрепления биомолекул в набухающем от воды полимерном геле и физического разъединения их, что делает их различимыми на обычных оптических микроскопах. С момента первоначальной публикации ExM менее десяти лет назад было разработано множество вариантов протокола ExM, и эти протоколы позволяют напрямую включать белки 5,6,7, РНК 8,9,10 или липиды11,12,13 в гелевую сеть путем изменения химического якоря или дальнейшего расширения образца (таким образом, улучшая эффективное разрешение) либо за одну стадию14, либо за несколько итерационных шагов15,16. До недавнего времени ни один протокол ExM не мог удержать эти три класса биомолекул с помощью одного коммерчески доступного химического якоря, обеспечивая при этом механически прочный гель, который мог расширяться в ~10 раз за один раунд расширения.
Здесь мы представляем Magnify17, недавнее дополнение к арсеналу ExM, которое использует метакролен в качестве якоря биомолекулы. Метакролин образует ковалентные связи с тканями, такие как параформальдегид, гарантируя, что несколько классов биомолекул могут удерживаться в гелевой сети, не требуя различных специфических или пользовательских якорных агентов. Кроме того, этот метод может расширить широкий спектр тканей до 11 раз, включая печально известные сложные образцы, такие как клинические образцы, зафиксированные формалином и парафином (FFPE). Предыдущие методы расширения таких механически жестких образцов требовали жесткого расщепления протеазы, что делало невозможным мечение антителами интересующих белков после расширения образца. В отличие от этого, этот метод позволяет расширить клинические образцы FFPE с помощью горячего денатурирующего раствора, тем самым сохраняя в геле целые белковые эпитопы, которые могут быть нацелены на визуализацию после расширения (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол Magnify 17, вариант ExM, который может удерживать несколько биомолекул с помощью одного химического якоря и расширять сложные клинические образцы FFPE до11 раз с помощью тепловой денатурации. Ключевые изменения в этом протоколе, которые отличают его …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Университетом Карнеги-Меллона и Благотворительным фондом D.S.F. (Y.Z. и X.R.), Национальными институтами здравоохранения (N.I.H.) Премия режиссера «Новый инноватор» DP2 OD025926-01 и Фонд Кауфмана.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
