यह प्रोटोकॉल विभिन्न तरीकों का वर्णन करता है जो एटीजी 9 ए जीव विज्ञान के अध्ययन में मदद कर सकते हैं, जिसमें इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद छवि विश्लेषण, क्षणिक ओवरएक्प्रेशन विचार और पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके एटीजी 9 ए ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच शामिल है।
ऑटोफैगी एक अत्यधिक संरक्षित मार्ग है जिसका उपयोग कोशिका होमियोस्टैसिस को बनाए रखने, क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल को नीचा दिखाने, हमलावर रोगजनकों का मुकाबला करने और रोग स्थितियों से बचने के लिए करती है। प्रोटीन का एक सेट, जिसे एटीजी प्रोटीन कहा जाता है, में कोर ऑटोफैगी मशीनरी शामिल होती है और एक परिभाषित पदानुक्रम में एक साथ काम करती है। हाल के वर्षों में अध्ययनों ने ऑटोफैगी मार्ग के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार किया है। हाल ही में, यह प्रस्तावित किया गया है कि एटीजी 9 ए पुटिकाएं ऑटोफैगी के केंद्र में हैं, क्योंकि वे फागोफोर नामक एक ऑर्गेनेल के तेजी से डी नोवो संश्लेषण को नियंत्रित करते हैं। एटीजी 9 ए का अध्ययन चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है, क्योंकि एटीजी 9 ए एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है, और यह विभिन्न झिल्ली डिब्बों में मौजूद है। जैसे, ऑटोफैगी को समझने के लिए इसकी तस्करी को समझना एक महत्वपूर्ण तत्व है। यहां, विस्तृत तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं जिनका उपयोग एटीजी 9 ए का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और विशेष रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग करके इसका स्थानीयकरण, जिसका मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित की जा सकती है। क्षणिक ओवरएक्प्रेशन के नुकसान को भी संबोधित किया जाता है। एटीजी 9 ए फ़ंक्शन का सही लक्षण वर्णन और इसकी तस्करी का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों का मानकीकरण ऑटोफैगी दीक्षा को नियंत्रित करने वाली घटनाओं को और अधिक चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
एटीजी 9 ए कोर ऑटोफैगी मशीनरी का एकमात्र ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है और गोल्गी और एक साइटोसोलिक एटीजी 9 ए पुटिका डिब्बे के बीच तस्करी की जाती है, जो एंडोसोमल कम्पार्टमेंट1 के माध्यम से पारगमन करती है। लंबे समय से गूढ़ होने के बाद, एटीजी 9 ए को हाल ही में लिपिड स्क्रैम्बलेस के रूप में कार्य करने के लिए वर्णित किया गया है, क्योंकि यह झिल्ली बाइलेयर 2,3 में लिपिड को बराबर करता है। अब यह स्पष्ट है कि एटीजी 9 ए ऑटोफैगोसोम गठन में पदानुक्रम के शीर्ष पर रहता है, और इसका अध्ययन, इस प्रकार, ऑटोफैगी 4,5 को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसे, एटीजी 9 ए पुटिकाओं को हाल ही में ऑटोफैगोसोम 6,7 के “बीज” के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एटीजी 9 ए केवल अपनी परिपक्वता के विभिन्न चरणों में ऑटोफैगोसोम बनाने वाले के साथ क्षणिक रूप से बातचीत करता है और ऑटोफैजिक झिल्ली 6,8,9,10,11 में एकीकृत नहीं होता है। इस प्रकार, ऑटोफैगोसोम गठन में एटीजी 9 ए की भूमिका और संभावित कई कार्यों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। हालांकि, वर्तमान मॉडल और पिछले डेटा के बीच विसंगति को केवल मान्य मात्रात्मक दृष्टिकोण और इंट्रासेल्युलर मार्करों का उपयोग करके एटीजी 9 ए की तस्करी को संबोधित करने वाले लक्षित प्रयोगों के माध्यम से हल किया जा सकता है।
एटीजी 9 ए का अध्ययन करने के लिए उपयोग में विभिन्न उपकरण हैं, जिनमें से प्रत्येक फायदे और नुकसान के साथ है, और इन उपकरणों का उपयोग एटीजी 9 ए की संरचना, इसके आणविक कार्य और सेलुलर तस्करी 2,8,12 से जटिल है। एटीजी 9 ए एक होमोट्रीमर बनाता है, ग्लाइकोसिलेटेड होता है, और पूरे सेल में गोल्गी, एंडोसोम और प्लाज्मा झिल्ली13,14 जैसे डिब्बों में तस्करी की जाती है। इसके जटिल यात्रा कार्यक्रम को देखते हुए, विशिष्ट उपचार या उत्तेजनाओं (जैसे पोषक तत्व और सीरम भुखमरी) पर गोल्गी से एटीजी 9 ए फैलाव जैसे रीडआउट की व्याख्या करने में कई चुनौतियां हैं। एटीजी 9 ए वेसिकुलर तस्करी के मामले में बेहद गतिशील है; दरअसल, एटीजी 9 ए युक्त पुटिकाओं को भुखमरी से प्रेरित ऑटोफैगी के संदर्भ में एटीजी 9 ए डिब्बे के रूप में परिभाषित किया गया है। इन गतिशील पुटिकाओं द्वारा गठित एटीजी 9 ए कम्पार्टमेंट, क्षणिक रूप से कई इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 8,15,16,17 के साथ बातचीत करता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस, लाइव इमेजिंग और ग्लाइकोसिलेशन परख सहित यहां वर्णित तकनीकों को एटीजी 9 ए जीव विज्ञान का पता लगाने और समझने में सहायता करनी चाहिए। विशेष रूप से, इस लेख में वर्णित दृष्टिकोण विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के स्थानीयकरण और विशिष्ट प्रोटीन भागीदारों और / या झिल्ली डिब्बों के साथ बातचीत के बारे में सवालों को संबोधित करने में मदद करेंगे। चूंकि एटीजी 9 ए हाइड्रोफोबिक संरक्षित कोर डोमेन (पीएफएएम डोमेन PF04109) में कई झिल्ली डिब्बों के बीच एक अद्वितीय टोपोलॉजी और एटीजी 9 ए चक्र हैं, इसलिए शोधकर्ताओं को कुछ नुकसान और कलाकृतियों के बारे में पता होना चाहिए जब क्षणिक रूप से एटीजी 9 ए को अतिरंजित किया जाता है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) प्रतिधारण शामिल है, लेकिन प्रतिबंधित नहीं है। अन्य संभावित मुद्दे प्रोटीन के गलत होने, सामान्य बढ़ती परिस्थितियों में कृत्रिम एकत्रीकरण, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उप-मानक परमेबिलाइजेशन प्रोटोकॉल के कारण वेसिकुलर डिब्बे की अपर्याप्त पहचान के कारण उत्पन्न हो सकते हैं।
अंतर्जात एटीजी 9 ए इमेजिंग करते समय, बाद के मात्रात्मक विश्लेषण की गुणवत्ता और डेटा की सही व्याख्या सुनिश्चित करने के लिए नमूना तैयारी और छवि अधिग्रहण में सावधानी बरतनी चाहिए। मानक जैव रासायनिक दृष्टिकोण (जैसे इम्यूनोप्रेसिपेशन या पुल-डाउन प्रयोगों को यहां वर्णित नहीं किया गया है) के साथ इस लेख में वर्णित तकनीकों के संयोजन से एटीजी 9 ए फ़ंक्शन की हमारी समझ में सुधार होना चाहिए। इस प्रयोगात्मक टूलकिट का उद्देश्य नए शोधकर्ताओं को अपने जैविक प्रणाली में एटीजी 9 ए के कार्य को निर्धारित करने के लिए आवश्यक कुछ परखों को नेविगेट करने में मदद करना है।
यह अध्ययन विभिन्न उपकरणों को दिखाता है जिनका उपयोग एटीजी 9 ए स्थानीयकरण की जांच के लिए किया जा सकता है। सबसे पहले, यह अध्ययन बताता है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एटीजी 9 ए की कल्पना कैसे की जा सकती है और इसे कैसे निर्धारित किया जा सकता है। दूसरे, जिन रणनीतियों का उपयोग एटीजी 9 ए को फिक्स्ड या लाइव कोशिकाओं में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग करने के लिए किया जा सकता है, उनकी तुलना की जाती है। अंत में, यह काम बताता है कि एटीजी 9 ए की ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच और उपयोग कैसे करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि एटीजी 9 ए ईआर से बाहर निकल गया है और गोल्गी के माध्यम से तस्करी की गई है।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अंतर्जात एटीजी 9 ए स्थानीयकरण के लक्षण वर्णन के बारे में, प्रयोग के लिए नियोजित निर्धारण और परमेबिलाइजेशन विधियों के साथ देखभाल की जानी चाहिए। यहां वर्णित मानक प्रक्रियाओं के अनुसार, डिजिटोनिन परमेबिलाइजेशन के साथ युग्मित पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण गोल्गी-संबद्ध एटीजी 9 ए और एटीजी 9 ए-पॉजिटिव पुटिका7 दोनों की कल्पना करने के लिए अच्छी स्थितियां हैं। निर्धारण और परमेबिलाइजेशन के साथ, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ इनक्यूबेशन का समय भी महत्वपूर्ण है। हमने देखा है, लेकिन प्रलेखित नहीं है, कि प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की उच्च सांद्रता और लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय एटीजी 9 ए के गोल्गी धुंधलापन में गलत वृद्धि का कारण बन सकता है, जो अंततः अन्य झिल्ली डिब्बों में एटीजी 9 ए पुनर्वितरण का पता लगाने से समझौता करता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि एटीजी 9 ए कई इंट्रासेल्युलर डिब्बों 1,13,17,22,23,24,27,28 में मौजूद है, इसलिए एटीजी 9 ए के साथ विशिष्ट झिल्ली मार्करों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, यह पहचानने के लिए कि एटीजी 9 ए कहां स्थित है। एटीजी 9 ए स्थानीयकरण को मापने के लिए अतीत में कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है, जिसमें पीयरसन के सहसंबंध गुणांक भीशामिल हैं। हालांकि, गोल्गी और अलग-अलग वेसिकुलर डिब्बे के साथ एटीजी 9 ए का आंशिक ओवरलैप पिक्सेल आउटलायर्स की एक उच्च संख्या की ओर जाता है, जो सहसंबंध गुणांक की व्याख्या को पूर्वाग्रह कर सकता है। इस कारण से, विश्लेषण किए जाने वाले दो डिब्बों में औसत प्रतिदीप्ति के अनुपात के आधार पर एक अधिक सरल दृष्टिकोण पसंद किया जाता है, और यह दृष्टिकोण सेल-दर-सेल परिवर्तनशीलता के प्रति कम संवेदनशील है। माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवि विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठकों को इस पुस्तक अध्याय30 पर निर्देशित किया जाता है।
एटीजी 9 ए की ग्लाइकोसिलेशन स्थिति की जांच करते समय, पश्चिमी धब्बे चलाने के लिए जैल का चयन महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के लिए, 3% -8% ट्रिस-एसीटेट जैल पसंद किए जाते हैं क्योंकि वे बड़े प्रोटीन के लिए उच्चतम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं, लेकिन वैकल्पिक जेल रचनाएं या रनिंग बफर जो उच्च-आणविक भार प्रोटीन का अच्छा पृथक्करण प्रदान करते हैं, का भी उपयोग किया जा सकता है। प्रयोगकर्ता वैद्युतकणसंचलन के समय को बढ़ाकर प्रोटीन के अधिकतम पृथक्करण को सुनिश्चित कर सकता है।
पश्चिमी धब्बा पर एटीजी 9 ए की कल्पना करने के लिए नमूने तैयार करते समय, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि लैम्ली बफर जोड़ने के बाद नमूने को उबाला न जाए; 95 डिग्री सेल्सियस पर उबलने से एटीजी 9 ए समुच्चय का निर्माण होता है, और बाद में, एटीजी 9 ए जेल1 में कुशलता से माइग्रेट नहीं होता है। 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को गर्म करनेकी सिफारिश की जाती है।
अभिकर्मक के उच्च स्तर आमतौर पर ईआर में एटीजी 9 ए के उच्च संचय का कारण बनते हैं, जबकि मध्यम अभिव्यक्ति स्तर प्रोटीन के शारीरिक स्थानीयकरण में मदद करते हैं। उपाख्यानात्मक रूप से, 48 घंटे के बजाय 72 घंटे के इनक्यूबेशन समय अक्सर ईआर स्थानीयकरण कलाकृतियों को कम करने में मदद करते हैं। विशेष रूप से, एमआरएफपी-एटीजी 9 ए एटीजी 9 ए तस्करी और कार्य पर सटीक रूप से रिपोर्ट कर सकता है यदि स्तर अभिव्यक्ति स्तरों के माध्यम से या स्थिर सेल लाइनों 8,9,22,27 का उपयोग करके नियंत्रित किए जाते हैं।
परिपक्व एन-लिंक्ड ग्लाइकेन प्राप्त करने के लिए अतिरंजित एटीजी 9 ए की आबादी की विफलता का उपयोग परेशान एटीजी 9 ए तस्करी के लिए रीड-आउट के रूप में किया जा सकता है। एटीजी 9 ए के कुछ क्षेत्रों को म्यूटेट या हटाने पर, ईआर प्रतिधारण में वृद्धि का खतरा होता है, जिससे परिपक्व एन-लिंक्ड ग्लाइकेन प्राप्त करने में विफलता हो सकती है और इस प्रकार, पश्चिमी धब्बा पर तेजी से पलायन करने वाला एटीजी 9 ए बैंड हो सकता है। कटे हुए एटीजी 9 ए संरचनाओं के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं को ईआर प्रतिधारण, ग्लाइकोसिलेशन राज्यों और गोल्गी स्थानीयकरण की जांच करनी चाहिए।
एटीजी 9 ए की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, एक एयरस्कैन माइक्रोस्कोप, फास्ट एयरस्कैन फ़ंक्शन पर निर्भर करता है, आमतौर पर लगभग 120 एनएम का इष्टतम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। स्थानीयकरण सटीकता के लिए, सुपर-रिज़ॉल्यूशन मोड में लगभग 1-2 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) की फ्रेम दरें इष्टतम हैं जो इस बात पर निर्भर करती हैं कि कितने चैनलों को चित्रित किया गया है। इसी तरह के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप जो उच्च गति पर छवि बना सकते हैं, उनका उपयोग एटीजी 9 ए पुटिकाओं की इमेजिंग के लिए भी किया जा सकता है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इमेजिंग गति सीधे घटनाओं का पता लगाने को प्रभावित कर सकती है और इसलिए, डेटा की व्याख्या को प्रभावित कर सकती है।
सारांश में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरेसेंस, लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी और इसकी ग्लाइकोसिलेशन स्थिति द्वारा एटीजी 9 ए स्थानीयकरण को निर्धारित करने और चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। ये प्रोटोकॉल एटीजी 9 ए के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं की सहायता कर सकते हैं और कुछ नुकसान से बचने में मदद कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग पहलुओं के लिए रोक्को डी’एंटुओनो को धन्यवाद देते हैं, साथ ही साथ ऑटोफैगी (एमसीबीए) प्रयोगशाला के आणविक कोशिका जीव विज्ञान के सभी वर्तमान और पिछले सदस्यों को उन चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं जिनके कारण इन प्रोटोकॉल का शोधन हुआ। ए.वी.वी., एस.डी.टी., ई.ए., एस.ए.टी., फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित थे, जो कैंसर रिसर्च यूके (सीसी 2134), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (सीसी 2134) से अपना मुख्य वित्त पोषण प्राप्त करता है। इस शोध को वेलकम ट्रस्ट (CC2134) द्वारा पूरे या आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बीवाई सार्वजनिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है।
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |