Denne protokollen beskriver ulike metoder som kan hjelpe i studiet av ATG9A-biologi, inkludert immunfluorescens etterfulgt av bildeanalyse, forbigående overekspresjonsbetraktninger og undersøkelse av ATG9A-glykosyleringsstatus ved bruk av western blot.
Autofagi er en svært konservert vei som cellen bruker for å opprettholde homeostase, nedbryte skadede organeller, bekjempe invaderende patogener og overleve patologiske forhold. Et sett proteiner, kalt ATG-proteiner, utgjør kjernemaskineriet for autofagi og arbeider sammen i et definert hierarki. Studier de siste årene har forbedret vår kunnskap om autofagiveien. Senest har det blitt foreslått at ATG9A-vesikler er i hjertet av autofagi, da de kontrollerer den raske de novo-syntesen av en organell kalt fagoforen. Studien av ATG9A har vist seg utfordrende, siden ATG9A er et transmembranprotein, og det er tilstede i forskjellige membranrom. Som sådan er forståelsen av menneskehandelen et viktig element for å forstå autofagi. Her presenteres detaljerte metoder som kan brukes til å studere ATG9A og spesielt lokalisering ved hjelp av immunfluorescensteknikker, som kan vurderes og kvantifiseres. Fallgruvene ved forbigående overuttrykk tas også opp. Den korrekte karakteriseringen av ATG9A-funksjonen og standardiseringen av teknikker for å analysere dens trafikk er avgjørende for ytterligere å karakterisere hendelsene som styrer autofagi-initiering.
ATG9A er det eneste transmembranproteinet i kjerneautofagimaskineriet og trafikkeres mellom Golgi og et cytosolisk ATG9A-vesikkelrom, som passerer gjennom det endosomale rommet1. Etter lenge å ha vært gåtefull, har ATG9A nylig blitt beskrevet å fungere som en lipid scramblase, da den likevekter lipider over membran dobbeltlag 2,3. Det er nå klart at ATG9A befinner seg på toppen av hierarkiet i autofagosomdannelse, og studien er derfor avgjørende for å forstå autofagi 4,5. Som sådan har ATG9A-vesikler nylig blitt foreslått som “frøet” til autofagosomet 6,7. Tidligere studier har imidlertid vist at ATG9A bare forbigående interagerer med det dannende autofagosomet ved forskjellige trinn i modningen og ikke integreres i autofagisk membran 6,8,9,10,11. Dermed er det behov for ytterligere undersøkelser for å fullstendig avdekke rollen og potensielle flere funksjoner av ATG9A i autofagosomdannelse. Imidlertid kan avviket mellom de nåværende modellene og de tidligere dataene bare løses gjennom målrettede eksperimenter som adresserer handel med ATG9A ved hjelp av validerte kvantitative tilnærminger og intracellulære markører.
Det finnes ulike verktøy i bruk for å studere ATG9A, hver med fordeler og ulemper, og bruken av disse verktøyene er komplisert av strukturen til ATG9A, dens molekylære funksjon og cellulær trafikk 2,8,12. ATG9A danner en homotrimer, glykosyleres og transporteres gjennom cellen til rom som Golgi, endosomene og plasmamembranen13,14. Gitt den komplekse reiseruten, er det flere utfordringer med å tolke avlesninger som ATG9A-spredning fra Golgi ved spesifikke behandlinger eller stimuli (som nærings- og serumsult). ATG9A er ekstremt dynamisk når det gjelder vesikulær trafikk; Faktisk har ATG9A-holdige vesikler blitt definert som ATG9A-rommet i sammenheng med sultindusert autofagi. ATG9A-rommet, dannet av disse dynamiske vesiklene, interagerer forbigående med flere intracellulære organeller 8,15,16,17. Teknikkene beskrevet her, inkludert immunfluorescens, levende bildebehandling og glykosyleringsanalyser, skal hjelpe til med deteksjon og forståelse av ATG9A-biologi. Spesielt vil tilnærmingene beskrevet i denne artikkelen bidra til å løse spørsmål om lokalisering til spesifikke cellulære rom og interaksjoner med spesifikke proteinpartnere og / eller membranrom. Siden ATG9A hydrofob konservert kjernedomene (PFAM-domene PF04109) har en unik topologi og ATG9A-sykluser mellom flere membranrom, bør forskere være oppmerksomme på visse fallgruver og artefakter når de forbigående overuttrykker ATG9A, inkludert, men ikke begrenset til, endoplasmatisk retikulum (ER) retensjon. Andre mulige problemer kan oppstå på grunn av feilfolding av proteinet, kunstig aggregering under normale vekstforhold eller utilstrekkelig påvisning av vesikulært rom på grunn av suboptimale permeabiliseringsprotokoller for immunfluorescens.
Ved avbildning av endogen ATG9A må det tas hensyn i prøvepreparering og bildeinnsamling for å sikre kvaliteten på den påfølgende kvantitative analysen og riktig tolkning av dataene. Kombinere teknikkene beskrevet i denne artikkelen med standard biokjemiske tilnærminger (for eksempel immunutfelling eller nedtrekkseksperimenter som ikke er beskrevet her) bør forbedre vår forståelse av ATG9A-funksjonen. Denne eksperimentelle verktøykassen er ment å hjelpe nye forskere med å navigere i noen av analysene som kreves for å bestemme funksjonen til ATG9A i deres biologiske system.
Denne studien illustrerer de ulike verktøyene som kan brukes til å undersøke lokalisering av ATG9A. For det første beskriver denne studien hvordan ATG9A kan visualiseres ved immunfluorescens og hvordan dette kan kvantifiseres. For det andre sammenlignes strategier som kan brukes til å merke ATG9A med en fluorescerende markør for visualisering i enten faste eller levende celler. Til slutt beskriver dette arbeidet hvordan man undersøker og bruker glykosyleringstilstanden til ATG9A for å avgjøre om ATG9A har forlatt ER og trafikkert gjennom Golgi.
Når det gjelder karakterisering av endogen ATG9A-lokalisering ved immunfluorescens, må det tas hensyn til fikserings- og permeabiliseringsmetodene som brukes til forsøket. I henhold til standardprosedyrene her beskrevet, er paraformaldehydfiksasjon kombinert med digitoninpermeabilisering gode forhold for å visualisere både Golgi-assosiert ATG9A og ATG9A-positive vesikler7. Sammen med fiksering og permeabilisering er tidspunktet for inkubasjon med den primære antistoffløsningen også kritisk. Vi har observert, men ikke dokumentert, at høyere konsentrasjoner av primær antistoffløsning og lengre inkubasjonstider kan føre til en misvisende økning i Golgi-fargingen av ATG9A, noe som til slutt kompromitterer deteksjonen av ATG9A-omfordeling til andre membranrom. I tillegg, siden ATG9A er tilstede i mange intracellulære rom 1,13,17,22,23,24,27,28, er det viktig å bruke spesifikke membranmarkører, sammen med ATG9A, for å identifisere hvor ATG9A befinner seg. Flere tilnærminger har blitt brukt tidligere for å kvantifisere ATG9A-lokalisering, inkludert Pearsons korrelasjonskoeffisient for kolokalisering29. Den delvise overlappingen av ATG9A med Golgi og det distinkte vesikulære rommet fører imidlertid til et høyt antall pikselavvik, noe som kan forstyrre tolkningen av korrelasjonskoeffisienten. Av denne grunn foretrekkes en mer forenklet tilnærming basert på forholdet mellom gjennomsnittlig fluorescens i de to rommene som skal analyseres, og denne tilnærmingen er mindre følsom for celle-for-celle-variabilitet. For ytterligere informasjon om bildeanalyse gjennom mikroskopi, henvises leserne til dette bokkapittel30.
Når man undersøker glykosyleringsstatusen til ATG9A, er valget av geler for å kjøre de vestlige flekkene viktig. For denne protokollen foretrekkes 3% -8% Tris-acetatgeler fordi de tilbyr den høyeste oppløsningen for større proteiner, men alternative gelsammensetninger eller løpende buffere som gir en god separasjon av proteiner med høy molekylvekt kan også brukes. Eksperimentøren kan sikre maksimal separasjon av proteiner ved å øke tiden for elektroforese.
Ved klargjøring av prøvene for å visualisere ATG9A på western blot, bør det utvises forsiktighet for ikke å koke prøvene etter tilsetning av Laemmli-bufferen. Koking ved 95 °C induserer dannelsen av ATG9A-aggregater, og ATG9A migrerer deretter ikke effektivt inn i gelen1. Det anbefales å varme opp prøvene ved 65 °C i 5 minutter27.
Høye nivåer av transfeksjon fører vanligvis til høyere akkumulering av ATG9A i ER, mens moderate uttrykksnivåer hjelper den fysiologiske lokaliseringen av proteinet. Anekdotisk bidrar inkubasjonstider på 72 timer i stedet for 48 timer ofte til å redusere ER-lokaliseringsartefakter. Spesielt kan mRFP-ATG9A nøyaktig rapportere om ATG9A-trafikk og funksjon hvis nivåene kontrolleres gjennom ekspresjonsnivåer eller ved å bruke stabile cellelinjer 8,9,22,27.
Svikt i en populasjon av overuttrykt ATG9A for å skaffe seg modne N-koblede glykaner kan brukes som en avlesning for forstyrret ATG9A-trafikk. Ved mutering eller sletting av visse regioner av ATG9A, er det fare for økt ER-retensjon, noe som kan føre til manglende anskaffelse av modne N-koblede glykaner og dermed et raskere migrerende ATG9A-bånd på western blot. Forskere som arbeider med avkortede ATG9A-konstruksjoner, bør sjekke for ER-retensjon, glykosyleringstilstander og Golgi-lokalisering.
For levende celleavbildning av ATG9A gir et Airyscan-mikroskop, avhengig av den raske Airyscan-funksjonen, optimal oppløsning på typisk ca. 120 nm. For lokaliseringsnøyaktighet er bildefrekvenser på rundt 1-2 bilder per sekund (fps) i superoppløsningsmodus optimale, avhengig av hvor mange kanaler som er avbildet. Lignende konfokale mikroskoper som kan avbilde med høy hastighet, kan også brukes til avbildning av ATG9A-vesikler; Det skal imidlertid bemerkes at bildehastigheten direkte kan påvirke deteksjon av hendelser og derfor påvirke tolkningen av dataene.
Oppsummert beskriver de presenterte protokollene måter å kvantifisere og karakterisere ATG9A-lokalisering ved immunfluorescens, levende cellemikroskopi og dens glykosyleringsstatus. Disse protokollene kan hjelpe forskere som arbeider med ATG9A og bidra til å unngå noen fallgruver.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Rocco D’Antuono for korrekturlesing av aspekter av manuskriptet, samt alle nåværende og tidligere medlemmer av laboratoriet Molecular Cell Biology of Autophagy (MCBA) for diskusjonene som førte til forbedringen av disse protokollene. A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T, ble støttet av Francis Crick Institute som mottar sin kjernefinansiering fra Cancer Research UK (CC2134), UK Medical Research Council (CC2134). Denne forskningen ble finansiert helt eller delvis av Wellcome Trust (CC2134). Med henblikk på åpen tilgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |