이 프로토콜은 면역형광 후 이미지 분석, 일시적인 과발현 고려 사항, 웨스턴 블롯을 사용한 ATG9A 당화 상태 조사를 포함하여 ATG9A 생물학 연구에 도움이 될 수 있는 다양한 방법을 설명합니다.
자가포식은 세포가 항상성을 유지하고, 손상된 세포소기관을 분해하고, 침입하는 병원균과 싸우고, 병리학적 조건에서 살아남기 위해 사용하는 고도로 보존된 경로입니다. ATG 단백질이라고 하는 단백질 집합은 핵심 자가포식 메커니즘을 구성하며 정의된 계층 구조에서 함께 작동합니다. 최근 몇 년 동안의 연구는 자가포식 경로에 대한 우리의 지식을 향상시켰습니다. 가장 최근에는 ATG9A 소포가 식체(phagophore)라고 불리는 세포소기관의 빠른 신 생 합성을 제어하기 때문에 자가포식의 핵심이라는 것이 제안되었습니다. ATG9A는 막관통 단백질이고 다른 막 구획에 존재하기 때문에 ATG9A에 대한 연구는 어려운 것으로 입증되었습니다. 따라서 자가포식을 이해하는 것은 자가포식을 이해하는 데 중요한 요소입니다. 여기에서는 ATG9A를 연구하는 데 사용할 수 있는 자세한 방법을 제시하며, 특히 평가 및 정량화할 수 있는 면역형광 기술을 사용하여 국소화를 수행합니다. 일시적인 과잉 표현의 함정도 해결됩니다. ATG9A 기능의 정확한 특성화와 그 트래피킹을 분석하기 위한 기법의 표준화는 자가포식 개시를 지배하는 사건을 더욱 특성화하는 데 매우 중요합니다.
ATG9A는 핵심 자가포식 기계의 유일한 막관통 단백질이며 골지체와 세포질 ATG9A 소포 구획 사이를 이동하며 엔도솜 구획1을 통과합니다. 오랫동안 수수께끼로 여겨졌던 ATG9A는 최근 막 이중층 2,3에서 지질을 평형화하기 때문에 지질 스크램블레이즈로 기능하는 것으로 설명되었습니다. 이제 ATG9A가 자가포식 형성에서 계층의 최상위에 존재한다는 것이 분명해졌으며, 따라서 ATG9A에 대한 연구는 자가포식 4,5를 이해하는 데 매우 중요합니다. 이와 같이, ATG9A 소포는 최근 자가포식 6,7의 “종자”로 제안되었습니다. 그러나, 이전 연구들은 ATG9A가 형성되는 자가포식체와 그것의 성숙의 다른 단계들에서 일시적으로만 상호작용하고 자가포식 막 6,8,9,10,11에 통합되지 않는다는 것을 보여주었다. 따라서 자가포식 형성에서 ATG9A의 역할과 잠재적인 다중 기능을 완전히 밝히기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. 그러나 현재 모델과 이전 데이터 간의 불일치는 검증된 정량적 접근 방식과 세포 내 마커를 사용하여 ATG9A의 이동을 다루는 표적 실험을 통해서만 해결할 수 있습니다.
ATG9A를 연구하는 데 사용되는 다양한 도구가 있으며 각각 장점과 단점이 있으며 이러한 도구의 사용은 ATG9A의 구조, 분자 기능 및 세포 이동으로 인해 복잡합니다 2,8,12. ATG9A는 호모트라이머(homotrimer)를 형성하고, 당화(glycosylated)되며, 세포 전체에서 골지체(Golgi), 엔도솜(endosome) 및 원형질막(plasma membrane)과 같은 구획으로 이동한다(13,14). 복잡한 여정을 감안할 때 특정 치료 또는 자극(예: 영양 및 혈청 결핍)에 대한 골지로부터의 ATG9A 분산과 같은 판독값을 해석하는 데 몇 가지 어려움이 있습니다. ATG9A는 소포 밀매 측면에서 매우 역동적입니다. 실제로, ATG9A 함유 소포는 기아 유발 자가포식의 맥락에서 ATG9A 구획으로 정의되었습니다. 이러한 동적 소포에 의해 형성된 ATG9A 구획은 여러 세포 내 소기관 8,15,16,17과 일시적으로 상호 작용합니다. 면역형광, 실시간 이미징 및 당화(glycosylation) 분석을 포함하여 여기에 설명된 기술은 ATG9A 생물학의 검출 및 이해에 도움이 될 것입니다. 특히, 이 기사에서 설명하는 접근법은 특정 세포 구획에 대한 국소화 및 특정 단백질 파트너 및/또는 막 구획과의 상호 작용에 대한 질문을 해결하는 데 도움이 될 것입니다. ATG9A 소수성 보존 코어 도메인(PFAM 도메인 PF04109)은 여러 멤브레인 구획 사이의 고유한 토폴로지와 ATG9A 주기를 가지고 있기 때문에 연구자들은 소포체(ER) 유지를 포함하되 이에 국한되지 않는 ATG9A를 일시적으로 과발현할 때 특정 함정과 인공물을 인식해야 합니다. 단백질의 잘못된 접힘, 정상적인 성장 조건에서의 인공물 응집 또는 면역 형광을 위한 최적이 아닌 투과화 프로토콜로 인한 소포 구획의 불충분한 검출로 인해 다른 가능한 문제가 발생할 수 있습니다.
내인성 ATG9A를 이미징할 때 후속 정량 분석의 품질과 데이터의 올바른 해석을 보장하기 위해 샘플 준비 및 이미지 획득에 주의를 기울여야 합니다. 이 기사에서 설명한 기술을 표준 생화학적 접근 방식(예: 면역침전 또는 풀다운 실험)과 결합하면 ATG9A 기능에 대한 이해가 향상될 것입니다. 이 실험 툴킷은 새로운 연구자들이 생물학적 시스템에서 ATG9A의 기능을 결정하는 데 필요한 일부 분석을 탐색하는 데 도움을 주기 위한 것입니다.
이 연구는 ATG9A 현지화를 조사하는 데 사용할 수 있는 다양한 도구를 보여줍니다. 첫째, 이 연구는 ATG9A가 면역형광으로 시각화되는 방법과 이를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다. 둘째, 고정 세포 또는 살아있는 세포에서 시각화를 위해 형광 마커로 ATG9A를 태그하는 데 사용할 수 있는 전략을 비교합니다. 마지막으로, 이 연구는 ATG9A가 ER을 빠져나와 골지체를 통해 트래피킹되었는지 확인하기 위해 ATG9A의 당화(glycosylation) 상태를 조사하고 사용하는 방법을 설명합니다.
면역형광에 의한 내인성 ATG9A 국소화의 특성화와 관련하여 실험에 사용되는 고정 및 투과화 방법에 주의를 기울여야 합니다. 여기에 설명된 표준 절차에 따르면, 디지토닌 투과화와 결합된 파라포름알데히드 고정은 골지-연관 ATG9A 및 ATG9A-양성 소포를 모두 시각화하기에 좋은 조건이다7. 고정 및 투과와 함께 1차 항체 용액을 사용한 배양 시기도 중요합니다. 1차 항체 용액의 농도가 높고 배양 시간이 길어지면 ATG9A의 골지체 염색이 잘못 증가할 수 있으며, 이는 결국 다른 막 구획으로의 ATG9A 재분포 검출을 손상시킬 수 있다는 것을 관찰했지만 문서화되지는 않았습니다. 또한 ATG9A는 많은 세포 내 구획 1,13,17,22,23,24,27,28에 존재하기 때문에 ATG9A가 위치한 위치를 식별하기 위해 ATG9A와 함께 특정 막 마커를 사용하는 것이 중요합니다. ATG9A 국소화를 정량화하기 위해 과거에 여러 접근법이 사용되었는데, 여기에는 공동 국소화에 대한 Pearson의 상관 계수29가 포함된다. 그러나 ATG9A와 골지(Golgi) 및 뚜렷한 소포 구획(vesicular compartment)의 부분적 중첩은 많은 수의 픽셀 이상치로 이어지며, 이는 상관 계수의 해석을 편향시킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 분석할 두 구획의 평균 형광 비율을 기반으로 하는 보다 단순한 접근 방식이 선호되며, 이 접근 방식은 세포별 변동성에 덜 민감합니다. 현미경을 통한 이미지 분석에 대한 자세한 내용은 이 책30장을 참조하십시오.
ATG9A의 당화(glycosylation) 상태를 조사할 때 웨스턴 블롯을 실행하기 위한 겔의 선택이 중요합니다. 이 프로토콜의 경우 3%-8% 트리스-아세테이트 겔이 더 큰 단백질에 대해 가장 높은 분해능을 제공하기 때문에 선호되지만 고분자량 단백질의 우수한 분리를 제공하는 대체 겔 조성물 또는 러닝 버퍼도 사용할 수 있습니다. 실험자는 전기영동 시간을 늘려 단백질의 최대 분리를 보장할 수 있습니다.
웨스턴 블롯에서 ATG9A를 시각화하기 위해 샘플을 준비할 때 Laemmli 버퍼를 추가한 후 샘플을 끓이지 않도록 주의해야 합니다. 95°C에서 끓이면 ATG9A 응집체의 형성이 유도되고, 그 후 ATG9A는 겔1로 효율적으로 이동하지 않는다. 샘플을 65°C에서 5분 동안 가열하는 것이 좋습니다27.
높은 수준의 transfection은 일반적으로 ER에서 ATG9A의 더 높은 축적으로 이어지는 반면, 중간 수준의 발현은 단백질의 생리학적 국소화에 도움이 됩니다. 일화적으로, 48시간 대신 72시간의 배양 시간은 종종 ER 국소화 아티팩트를 줄이는 데 도움이 됩니다. 특히, mRFP-ATG9A는 발현 수준을 통해 또는 안정된 세포주를 사용하여 ATG9A 트래킹 및 기능을 정확하게 보고할 수 있다(8,9,22,27).
과발현된 ATG9A 집단이 성숙한 N-결합 글라이칸을 획득하지 못하는 것은 교란된 ATG9A 트래피킹에 대한 판독값으로 사용할 수 있습니다. ATG9A의 특정 영역을 돌연변이시키거나 삭제할 때 ER 머무름이 증가할 위험이 있으며, 이는 성숙한 N-결합 글라이칸을 획득하지 못하여 웨스턴 블롯에서 더 빠르게 이동하는 ATG9A 밴드를 획득하지 못할 수 있습니다. 잘린 ATG9A 구조체를 사용하는 연구원은 ER 머무름, 당화 상태 및 골지 국소화를 확인해야 합니다.
ATG9A의 라이브 셀 이미징을 위해 고속 Airyscan 기능에 의존하는 Airyscan 현미경은 일반적으로 약 120nm의 최적 해상도를 제공합니다. 위치 파악 정확도를 위해 초고해상도 모드에서 초당 약 1-2프레임(fps)의 프레임 속도는 이미징되는 채널 수에 따라 최적입니다. 고속으로 이미징할 수 있는 유사한 컨포칼 현미경은 ATG9A 소포의 이미징에도 사용할 수 있습니다. 그러나 이미징 속도는 이벤트 감지에 직접적인 영향을 미칠 수 있으므로 데이터 해석에 영향을 미칠 수 있습니다.
요약하면, 제시된 프로토콜은 면역형광, 살아있는 세포 현미경 및 당화 상태를 통해 ATG9A 국소화를 정량화하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 ATG9A로 작업하는 연구원을 지원하고 몇 가지 함정을 피하는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자들은 원고의 교정을 해준 Rocco D’Antuono와 이러한 프로토콜의 개선을 이끈 논의에 대해 MCBA(Molecular Cell Biology of Autophagy) 실험실의 모든 현재 및 과거 구성원에게 감사를 표합니다. A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T.는 영국 암 연구(Cancer Research UK, CC2134), 영국 의학 연구 위원회(UK Medical Research Council, CC2134)로부터 핵심 자금을 지원받는 프랜시스 크릭 연구소(Francis Crick Institute)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 웰컴 트러스트(Wellcome Trust, CC2134)의 자금 지원을 받았습니다. 오픈 액세스를 위해, 저자는 이 투고에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC BY 공개 저작권 라이선스를 적용했습니다.
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |