يوفر هذا البروتوكول سير عمل سهل المتابعة لإجراء تنقية الحمض النووي الريبي poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة باستخدام معدات موحدة لعينة بيولوجية ذات أهمية.
ترتبط تعديلات ما بعد النسخ للحمض النووي الريبي في أنواع مختلفة من نسخ الحمض النووي الريبي بتنظيم الحمض النووي الريبي المتنوع في الخلايا حقيقية النواة. وقد تبين أن تعديلات الحمض النووي الريبي الشاذ 5-ميثيل سيتوزين والتعبير غير المنظم لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي مرتبطة بأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطانات. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول ثنائي الكبريتيت عند دقة زوج القاعدة. هنا ، يعرض هذا البروتوكول إجراءات جولتين من تنقية poly (A) RNA ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة بالتفصيل للسماح برسم خرائط على مستوى النسخ لمواقع تعديل mRNA 5-methylcytosine. يعد تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي بعد التفاعل الرئيسي أمرا ضروريا لمراقبة سلامة الحمض النووي الريبي وهو خطوة حاسمة لضمان مكتبات تسلسل عالية الجودة. من الناحية المثالية ، يمكن إكمال الإجراءات في غضون ثلاثة أيام. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن أن يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة كمدخل عمليا إلى بناء مكتبات ثنائية الكبريتيت-mRNA قوية لتسلسل الجيل التالي من عينة الاهتمام.
من بين أكثر من 150 نوعا من تعديلات ما بعد النسخ1 ، تم تحديد تعديل 5-methylcytosine (m5C) في أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي ، والحمض النووي الريبي المنقول ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الصغير ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبي القبو ، والحمض النووي الريبي المحسن ، والحمض النووي الريبي الصغير الخاص بالجسم2. يرتبط الحمض النووي الريبي m 5 C بآليات بيولوجية ومرضية متنوعة مثل تنظيم نمو جذر النبات3 ، والتعبير الجيني الفيروسي4 ، وتطور السرطان5. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوط أنابيب مبسطة لتوصيف ملف تعديل mRNA m5C على نطاق النسخ للعينات البيولوجية في مراحل النمو المختلفة أو في بيئة المرض. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول للكبريتيت عند دقة زوج القاعدة6،7،8،9. هذا مفيد بشكل خاص عند دراسة ارتباط m5C بالتعبير الجيني ومصير الحمض النووي الريبي الذي يشارك في الآليات التنظيمية البيولوجية في الخلايا. في خلية الثدييات ، هناك نوعان معروفان من قارئي m 5 C: يمكن ل ALYREF التعرف على m 5 C في النواة ويعمل كناقل mRNA من نواة إلى سيتوسول10 ، بينما يمكن ل YBX1 التعرف على m5C في السيتوبلازم وزيادة استقرار mRNA11. تم الإبلاغ عن انحراف m5C mRNAs المتعلقة بالمسارات المناعية في خلايا الذئبة الحمامية الجهازية CD4 + T12. كشفت الدراسات عن وجود علاقة بين تعديل mRNA m5C وتعديل مناعة السرطان وتطور السرطان13,14. ومن ثم، فإن رسم خريطة ملف تعريف تعديل m5C على mRNA يمكن أن يوفر معلومات حاسمة لتوضيح الآلية التنظيمية المحتملة.
للتحقيق في الأدوار الوظيفية لتعديل الحمض النوويالريبي m 5 C في ظل ظروف بيولوجية معينة ، يمكن دمج النهج القائمة على تحويل ثنائي الكبريتيت (bsRNA-seq) والنهج القائمة على إثراء تقارب الأجسام المضادة مثل m 5 C-RIP-seq و miCLIP-seq و 5-Aza-seq مع منصة التسلسل عالية الإنتاجية لتوفير الكشف الفعال عن المناطق والتسلسلات المستهدفة مع تعديلات m5C على مقياس واسع للنسخ15 ، 16. توفر ميزة هذا البروتوكول المشهد الشامل للحمض النووي الريبيm 5 C بدقة قاعدة واحدة لأن النهج القائم على إثراء تقارب الأجسام المضادة يعتمد على توافر أجسام مضادة عالية الجودة ويمكن أن يحقق دقة الجزء الواحد من مشهد مثيلة m5C17.
ستتم معالجة جميع عينات الحمض النووي الريبي بجولتين من إثراء mRNA باستخدام حبات oligo (dT) ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد مكتبة التسلسل. لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي ، سيتم فحص كل عينة من الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري قبل وبعد إجراءات تنقية mRNA وتفاعل ثنائي الكبريتيت لتقييم توزيع الشظايا. سيتم فحص المكتبات المنقاة من خلال صفات amplicon PCR الخاصة بها ، وشظايا توزيع حجم الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري ، وفحص كمياتها الإجمالية بواسطة المقايسات الكمية القائمة على الأصباغ الفلورية قبل التسلسل. يمكن أيضا استخدام النظام لتحليل مجموعة واسعة من العينات البيولوجية مثل المنتجات الزراعية ، والفيروسات المعزولة ، وخطوط الخلايا ، والكائنات الحية النموذجية ، والعينات المرضية.
في هذا البروتوكول ، تم تحقيق خط أنابيب مفصل لإثراء poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة من خلال استخدام مكونات موحدة. قدم تحليل التسلسل الإضافي تحديد mRNA 5-methylcytosine في العينات ذات الأهمية.
الخطوة الحاسمة هي جودة بدء المواد – إجمالي الحمض النووي الريبي – لأن تدهور الحم…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |